影响液相色谱柱柱效测试结果的原因（一）物理因素

由于近期进行了色谱柱的分类及整理，对于早先项目所使用过的色谱柱需逐步进行柱效测试并评价，以完善色谱柱的系统管理及其利用率。故本周会对柱效相关问题进行讲述，以期对柱效的测试更加的理解，能在柱效测试的工作过程当中灵活运用。

柱效（column efficiency）是色谱柱在色谱分离过程中主要由热力学因素(操作参数)所决定的分离效能。通常用理论塔板数（或者有效塔板数、理论塔板高度、有效塔板高度等）表示。柱效是衡量色谱柱性能的一项主要指标，柱效越高，分离能力越强。

关于塔板数的计算，在之前的推文中有所表述，这里就不过多介绍，有兴趣的同学可以翻到前面分离度相关章节了解，均有介绍。

柱效测试方法可以根据每根色谱柱附带的测试报告（Performance Report）提供的方法条件进行试验。通常实际测试结果比色谱柱所附的测试报告结果偏低是正常的。因为仪器公司测试塔板数的HPLC系统是专门设计的，整个系统扩散体积非常小。

如果新柱测试结果与报告中有很大不同，很大可能是由于色谱系统配置以及死体积等因素的影响。通常需要考虑的因素有以下几方面：

1.不同柱外体积的影响

柱外体积是指“额外”或“外部”（相对于色谱柱）体积，是系统的一部分，尤其是各LC部件、色谱柱之间的连接管线体积、进样体积和流通池体积。（在有些文献表述为Dwell Volume；而我们日常所说的色谱柱死体积通常表述为Dead volume）

对于各部件的连接管线，为了减少体积可以使用更小内径的管线。

下面的例子就显示了柱外体积的影响。当使用较小的柱子时，10µl的柱外体积可以得到良好的分离结果，当加上一段管线形成50µL的柱外体积，色谱峰变宽、分离度降低。在向系统中添加体积不明的管线时，这种情况经常发生。添加一段太长的管线，或内径较大的短管时，会使高柱效色谱柱的分离度变差。

不同内径的管线对色谱峰展宽的影响。管线内径越大，样品谱带在管线内发生的扩散也就越大，色谱峰展宽也就越严重。当然，内径越大，同等长度的管线带进去的柱外体积也越大。

原则上，系统的最大柱外体积（管线体积、进样体积和检测器体积）不应超过柱体积的10%。

2.管线和色谱柱连接的接头是否合适

关于这点，我们在之前的《色谱接头常见问题》一文中有详细的介绍，这里就大致简单说一下，需要了解的请点击色谱接头常见问题温故一下。

关于接头问题的处理方式是使用与色谱柱匹配并连接恰当的管线和接头。如上图所示，连接不恰当的接头，会造成色谱峰的展宽。比如，如果密封圈位置不正确，管线从密封圈伸出过长，会使密封圈与色谱柱入口螺纹产生空隙而发生漏夜；管线从密封圈伸出过短，将产生一段死体积，形成混合腔，导致柱外体积增加，使色谱峰展宽。故一定要使用匹配的正确接头，并保证色谱柱末端接头位置正确。

3.不同流通池体积的影响

如果您使用的是较小体积的色谱柱，则流通池体积的影响更大，需要使用微量或半微量流通池。标准流通池会增大柱外体积。如上图所示，不同大小的流通池对体积较小的柱子在柱效上的影响。故当您使用的是较小体积的色谱柱，需要使用微量或半微量流通池。标准流通池会增大柱外体积。