影响液相色谱柱柱效测试结果的原因（二）其他因素

在上篇《影响液相色谱柱柱效测试结果的原因（一）-物理因素》一文中讲述的在液相色谱柱柱效测试过程中，不同柱外体积以及管线和色谱柱连接的接头是否合适，以及流通池体积大小三大大物理因素对柱效测试结果的影响。今天，我们继续讨论并分析在测试过程中通常需要考虑的其他因素。

柱效测试方法可以根据每根色谱柱附带的测试报告（Performance Report）提供的方法条件进行试验。通常实际测试结果会比色谱柱所附的测试报告结果偏低，这是正常的。因为色谱柱公司测试塔板数的高效液相色谱系统是专门设计的，整个系统扩散体积非常小。

如果测试结果与报告中有很大不同，很大可能是由于色谱系统配置以及死体积等因素的影响。通常需要考虑的因素除了不同柱外体积以及管线和色谱柱连接的接头是否合适，流通池体积大小三大物理因素外，还有以下几方面：

1.   柱效测定使用的检测物
      检测物的选择需要保证检测物是化学惰性和稳定的，避免检测物与固定相发生其他表面相互作用。此外，洗脱组分和样品的粘度和密度差异应降低至最小，以避免由不稳定流动模式（粘度效应）而造成的系统误差。所以在本文开始的时候，一直强调根据每根色谱柱附带的测试报告（Performance   Report）提供的方法条件进行试验，以达到最佳柱效测试条件。若没有测试报告中所列的检测物，甲苯是一个很好的选择。可在新柱子启用前用甲苯测试一下，得到一份内部色谱柱评价报告。然后在需要的时候用相同的色谱条件再次对色谱柱进行评价，对比前后测试结果的差异来评价色谱柱。

2.流速

峰的展宽程度以及导致的色谱的柱效在很大程度上取决于检测过程中所使用的流速。理论上，峰展宽和液体流速之间的关系可通过范德姆特方程进行描述：

其中 A 指的是湍流扩散； B 指的是分子扩散； C指的是传质阻力；u指的是液体流速（cm/h）。

液体流速对柱效的影响如图所示：

当液体流速在20 cm/h左右时折合塔板高度最小且柱性能最大。当速度降低时，由于范德姆特方程中B对应的分子扩散使得柱效柱效有所降低。在高检测速度时，由于在固定相中保留时间缩短，根据范德姆特方程中C代表的粒内扩散受到限制，导致峰宽增加。值得一提的是图中的峰的对称因子随液体速度的提高而减小，这主要还是由于建立的检测方法减小峰的展宽从而影响到对称性。

3. 不同检测器采样频率的影响

使用小体积色谱柱时，数据采集速率是“人为”峰展宽的常见原因。对于快速洗脱的色谱峰，要确保在色谱峰上收集到足够的数据点，数据系统才能描述出真实的色谱峰，才能准确测定出峰宽、峰面积和保留时间，否则，表观出的色谱峰会失真。如果得到的数据点太少（低数据采集频率），色谱峰就会显得比其实际要宽。如图四所示，当增加了采样速率，色谱峰的柱效有了明显的提高。当然，这里的高柱效并不是因为采样频率带来的，较高的采样频率只是表观了更加真实的色谱峰。在采样频率达到了一定的程度，即便再增加频率，也无法增加柱效。