徕卡冰冻超薄切片技术

 徕卡冰冻超薄切片技术是使样品迅速冷冻，然后用冷冻切片机进行徕卡冷冻超薄切片。它省去了普通超簿切片法中繁杂的化学固定与包埋操作，在细胞化学研究中有着特殊的用途。为了很好保存形态结构，必须使游离水形成玻璃态的冰，防止产生冰晶。这就要求很高的冰冻速率（~度/秒），这对于传热性能差的生物材料来说是困难的。一般除了尽可能地提高冷冻速率外，还可考虑采用尽可能小的样品尺寸（小于1立方毫米），对样品进行冷冻保护处理等，但通常也只能在样品表面几微米到几十微米范围内能达到玻璃态。更深层将会因冷冻速率低而产生冰晶损伤。

1、仪器准备

进行冷冻超薄切片必须使用专门的徕卡冷冻超薄切片机或配有徕卡冷冻超薄切片附件的普通超曲切片机。德国生产的LeciaCM3050S型和LeciaCM1950冻切片机，可用于冷冻超薄切片。

2、醛类固定

戊二醛固定可良好保存结构和生物大分子的活性，而且结合冷冻保护剂能有效防止冰品的产生。典型的固定液是：0.1M二甲胂酸钠缓冲液（pH7．2）的2.5％戊二醛溶液，固定时间约1小时，固定温度37℃。

3、包封

即用某些分子量较大的物质将组织包埋起来，以便切出大面积平整的切片。这些物质不渗入细胞内部，只渗入细胞间隙，起临时成形和支持作用。具体方法：将组织放在事先溶解好的20％的明胶溶液中保温15—30分钟，然后在冰箱中凝固，使样品包封。也可以用甲基纤维索、牛血清蛋白等代替明胶，不进行包封亦可以获得较好的切片。

4、徕卡冷冻保护处理

在包封之后，将样品放在30％~50％甘油中浸泡5~30分钟，进行冷冻保护处理。甘油效果较好，它不容易污染切片，具有湿润作用，有利于切片。

5、徕卡快速冷冻

这是获得高质量冷冻切片的关键，常用的方法有三种：

①用液氮直接冷冻在样品架上滴上一滴缓冲液，放上预处理过的样品，一起直接放入液氮冷冻。这种方法如上述由于存在汽泡绝热层，冷冻速率低，效果不佳。

②间接冷冻法采用某些低熔点，高沸点，高热容量及传热好的中间冷媒，如：乙烷、异戊烷、丙烷、氟里昂等。将一金属容器置于液氮中，再将中间冷媒注入容器中，待中间冷媒冷却后，然后把样品投入个间冷媒的容器中冷冻。由于这些冷媒不会沸腾和形成绝热泡层，因此，冷冻速率高，效果较佳。

③金屑接触冷冻法将一铜块至于液氮中，待温度平衡后，取出铜块并将样品与它接触0.3~0.5秒，使样品冷冻后，投入液氮中，继续冷冻。此法出于样品预先冷冻，样品放入液统中不会产生绝热的汽泡层，冷冻效果较好，特别适用于无溶液制备法。

6、切片

要进行徕卡冰冻超薄切片首光必须熟练掌握普通徕卡常规超薄切片技术。在进行切片之前要将样品块修整好。方法可用徕卡切片机修块；也可在液氮中用一长柄刀片修整，但这两种方法都不易掌握，效果不佳。较合适的方法是：将组织块在戊二强固定的过程中，用刀片修整成适合于切片的梯形，并仔细放置在样品架上进行冷冻。