循环测序：利用PCR和引物末端标记进行双脱氧测序实验

ddNTP 延伸 终止混合物酶及其缓冲液AmpliTaq CS 或其他无外切酶活性的 DNA 聚合酶循环测序缓冲液热稳定的 DNA 聚合酶核酸和寡核苷酸模板 DNA

小离心管 或者微孔板热循环仪

材料

溶液和缓冲液

贮存液、缓冲液和试剂的配方请参照附录 1。
将贮存液稀释到适当的浓度。

ddNTP 延伸/终止混合物

ddNTP 溶液：四种 ddNTPs, 各 5.0 mmol/L
dNTP 溶液：四种 dNTPs, 各 1.0 mmol/L
EDTA(0.05mol/L,pH8.0)
甲酰胺上样缓冲液
Tris-Cl(1mol/L,pH8.0)

酶及其缓冲液

AmpliTaq CS 或其他无外切酶活性的 DNA 聚合酶（5units/ul)。

5X 循环测序缓冲液
200 mmol/LTris-Cl(pH8.8)
25 mmol/LMgCl₂

热稳定的 DNA 聚合酶
选择酶时，请参照本章介绍中及方法 5 中表 12-19 的介绍选择测序系统。该方法依据 AmpliTaqCS 写出. 但其他类似的热稳定酶同样可用。

核酸和寡核苷酸
寡核苷酸引物，5'端由 33P 或 32P 放射性标记
请见第 10 章，方案 2。

模板 DNA
质粒、黏粒、λ噬菌体和噬菌体 M13DNA 以及通过第 1~4 章中任何方法得到的 DNA 都可以用作模板。表 12-12 表明了每种摸板的需要量（同时参考表 12-4)。

特殊装置

小离心管（0.5 ml) 或者微孔扳（柔软，热稳定，96 个 300ul 溶剂 U 型孔）
这些板可被标记以不同彩色和/或标上 C、T、A 和 G 字样。
设计好的热循环程序（见步骤 5)。

方法

1.将每一种ddNTP混合物（参考表12-11)各4ul放入相应的0.5ml离心管或微孔板中。置于冰上。



2.在每管/孔中加人：

双链DNA模板                                                    10~100fm
1.5pmoles 5'端由32P放射性标记的引物           1.0ul
5X循环测序缓冲液                                             2.0ul
加水                                                                   至5.0ul

*如果使用³³P末端标记的引物：使用5pm标准制备的由³³P放射性标记的寡核苷酸(参见附录方法：使用PCR和[a-³²P]dNTP内部标记进行的循环测序反应为保证测序混合物的化学计量。可在不增加反应体积的情况下将DNA量增加3倍（30—300fm）。

3.在1X循环测序缓冲液中将AmpliTaq CS聚合酶溶解至0.5~1.0U/ul。将1ul溶解好的酶溶液加入孔或管中。

4.轻弹管壁或摇动微孔板使物质混合。如果需要，在反应上加一滴矿物油，盖上管盖，2000r/m离心2s。确认矿物油未被紫外线照射过.否则会产生PCR的强抑制剂。

5.将管或微孔板放入PCR仪，预热到95°C。依据以下程序操作。
重要：开始程序时切勿拖延。保证在95°C预热时间不趙过3min。否则DNA聚合酶会失活。



6.取出板或管，分别加入5ul甲酰胺加样缓冲液。

7.反应物可在-20°C保存5天或直接用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析（方案8,9,10,11和12）。变性后（100°C 2min),在冰上骤冷，每种反应物用3ul上样。