微流控技术的PCR生物微芯片技术原理！

　　基于数字流控(DMF)的聚合酶链式反应 (PCR)微芯片系统设计 ，主要在于对样品液滴的运动进行控制和对进行PCR所需要的温度控制 。设计了一种基于介电润湿 (Ew0D)原理的数字微流控PCR微芯片，并实现了对芯片不同区域的温度控制以满足PCR所需的要 求。基于数字微流控技术的PCR微芯片系统由一个双基板结构的数字微流控芯片 ，芯片的驱电路以及温度控 制组件构成 。实现驱动样 品液滴在该装置上运动至不同温度的反应区域 ，在不同的反应区域满足的PCR反应所需的变性 ，退火和延伸 各阶段所需 的温度 ，继而实现PCR扩增 。

　　随着微机电系统 (MEMS)技术的发展 ，数字微流控芯片已经在微液滴 的驱动和控制技术等方面有所突破 ，依靠其自身优势在生物 、化学和医药等领域得到了广泛的应用 。各种细胞等样品可以在数字微流控芯片中培养 、移动和分析。从各个领域的广泛应用可以看出 ，数字微流控芯片有着体积小 、试剂使用量小、反应快 、易携带 、可并行处理和易实现自动 化等优势口，并且已经开始商业化 。

　　1，常见的PCR微流控芯片

　　常见的PCR微流控芯片主要有两种：微反应腔式PCR芯片和连续流动式 PCR 芯片 。微反应腔式PCR芯片是指在芯片上加一个腔体用来储存实验试剂 ，通过加热器件和降温器件对腔体加热和降温来达到PCR扩增各阶段所需要的温度 ，经过一次温度循环完成一次扩增过程，但由于升降温的速率由加热器件和降温器件控制 ，且温度的升高和降低都有一个时间过程 ，每个增值循环的时间都比较长。连续流动式PCR芯片通过控制试剂在芯片内的通道上连续流动 ，经过3个不同的温度区域 ，在3个区域分别实现DNA变性 、退火和延伸 。实验试剂每在3个区域经历一个循 环 ，就完成了一次DNA 扩增的过程 ，但是因为实验样品在芯片内是不 停流动的，所以反应时间等变量的控制主要通过设计芯片上微通道的结

　　构来实现 ，通常结构相对更复杂也需要比较大的空间 。为了解决上述两种PCR 芯片的缺点，本文采用了基于介电润湿的数字微 流控技术设计了一种PCR微芯片 。

　　在芯片上控制3个不同的区域稳定在PCR反应3个阶段所需要的温度 。控 制反应试剂液滴流经 3个温度区域 ，每循环一次 ，便完成一次 DNA 的增值 。但同时由数字微流控技术的原理和特点町知。数字微流控在芯 片上是以液滴为单位对每个单独的液滴进行控制 。实验试剂在每个区域 行进和停留的时间都可以根据需要自己设定 ，所以芯片并不需要设计 很长的通道 ，仅需要使试刹液滴停留在反映区域一段时间即可。可以在 芯片的设计上实现微反心腔式PCR芯片结构简单小巧的特点。同时仅需控制试验液滴运动至不同的温度区域即可完成对应的反应过程 ，系统不需要对芯片上 的反应区域有升温或者降温的操作 ，仅需要保持3个反应区域的温度稳定 ，兼具连续流动式PCR芯片循环速度快不需要升降温过程的优点。

　　2， 系统设计与制备

　　本文设计的基于介电润湿技术的数字微流控PCR微芯片系统由数字微流 控芯片 ，数字微流控芯片驱动电路和温度控制系统3部分组成，其中数字微流控芯片和数字微流控芯片驱动电路实现试剂样本液滴的驱动 ，温度控制系统则保证芯片上不同反应域的所需温度的实现和稳定。

　　2.1 数字微流控芯片设计与制备

　　利用微机械加工工艺。设计制备了应用于PCR 的数字微流控器件。器件 由试剂储藏区域 、反应区域 、检测区域 、连接各区域的传输部分以 及 电极和电极接线组成 。为保证实验试剂不受到外界的污染以及液滴运动的稳定可靠 。本文设计 的数字微流控 PCR微芯片采用双基板结构。

　　上基版采用玻璃作为基底材料 ，在玻璃基板表面通过真空蒸发沉积的 方法制备薄膜作为导电层 ，之后通过旋涂 ，烘烤制备一层Teflon涂层 作为疏水层 ，制作工艺与下基板疏水层制作二艺相同。两基板间采用 PDMS加工出电极上方液滴运动所需的空隙 ，与上下基板建合形成液 滴运动的通道 。

　　2.2 数字微流控芯片控制驱动电路设计

　　数字微流控芯片驱动液滴需要控制驱动电路 。该电路可以按照一定顺 序使 一定幅值的电压按所需要的通断顺序和频率施加在数字微流控芯 片的电檄上 ，进而使芯片上的液滴按照所需的速度方向运动 ”。

　　2.3 温度控制系统设计与实现

　　在PCR微芯片中 。通过数字微流控系统驱动样品液滴运动至3个不同的反应温温度区域，在不同的区域实现变性，退火和延伸反应，完成扩增在数字微流控PCR微芯片中。不同反应域的温度保持不变，试剂在芯片中由配发区域产生试剂液滴。液滴循环的经过3个不同的区域。每经过 一次循环实现一次扩增过程 。

　　温度控制系统由加热部件 ，温度采集和温度控制器3部分组成 。加热 部件是整个温度控制器的重要组成部分。由于双基板结构数字微流控卷片的内部为液滴的通道 。所以加热部件只能设置在上板上方或下基板 的下方 。由于芯片上部设 计为透明的基板以便对芯片内部液滴运动情况的观察 ，而若选择 将加热器放置在卜部 ，则会对观察造成遮挡 ，不 便在实验中实时的观察芯片内部的运行情况。本实验设计的方案选择将 加热器部件放置在芯片下基板的下方部位 。

　　本系统采用电阻值R一10Q陶瓷加热片作为加热系统的热源，在加压U一 10V的时候最大干烧温度可以达到210℃。具有体积小、重龉轻、热响 应时间快的优点，完全可以满足系统的需要。温度采集部分采用PT00铂

　　电阻作为温度采集传感器。铂电阻具有体积小巧，精度高的优点 ，可以满足系统高精度的测温需求一。温度控制器采用OMRC)NE5CN—R2MTD型温控器 ，具有采样速度快。精度高的优点，并可以自行输入 PID参数对温度进行控制进而实现温度控制的稳定可靠。

　　3，实验结果与讨论

　　3.1 温度控制系统

　　由于加热片及温度采集都装置在数字微流控芯片的下基板外侧。所以实验中温度控制器设定的温度应稍高于PCR反应各个阶段所需的温度，但在系统稳定后，反应区域内部和控制器设定温度的羞值基本周定，所以 通过设置 ，仍可以使数字微流控芯片反应的各个区域温度稳定在所需 要的数值。住窄温下(3O℃)使用测温仪对反应区域进行检测得到本数字微流控 PCR 片各个区域的温度控制曲线 。

　　3.2 数字微流控PCR微芯片

　　本文方案制得的数字微流控PCR徽芯片通过介电润湿技术控制可以样品液滴在芯片中的运动，实现液滴分配，移动等操作。

　　由于数字微流控技术可以精确地产生许控制每个液滴的特点，在实验 中，实验试剂在储藏区域经由液滴分配的过程生成试剂液滴。每个液滴都可以视为PCR微芯片中的1个扩增反应的微反应窜，试样通过芯片的 控制运动经过3个反应区域 。每经历1个温度循环，就完成 1次扩增过 程。这种基于数字微流控技术的PCR微芯片大大降低了PCR微芯片的复杂度的操作难度。试样液滴在反应区域经过多次循环后，完成样品 DNA的扩增。之后将试样液滴移动至检测区域进行检测 。

　　基于数字微流控技术的PCR微芯片，应用介电润湿原理通过 对微液滴状的样品在芯片上的运动进行控制。可以有效的减少所需的样品量。通过对芯片中几个反应区域的温度控制，实现样品在芯片中的聚 合酶链式反应。有效的简化了 PCR微芯片结构，具有结构简单小巧的特 点，控制方式稳定可靠，系统不需要对芯片上的反应区域有升温或者降温的操作，仅需要保持3个反应区域的温度稳定，PCR 每个温度循环所 需时大大减小。

　　仪需控制试验液滴运动至不同的温度域即可完成对应的反应过程 。在后 续的实验中可以增加对芯片的实时荧光检测功能，荧光检测中可实时对芯片中样品液滴中的DNA扩增进行检测 ，可有效的提高检测效率并增 加检测结果的精确性 。