微生物制备复合酶制剂的研究进展

酶是一种具有催化活性的蛋白质，因此，酶具有催化剂的特点，同时，酶具有蛋白质的属性。酶作为一种食品添加剂具有很多优点：（1）酶催化的反应能够在常温常压下进行，而且具有很高的效率和专一性，它不会有任何有害残留物质；（2）其用量小，经济合算；（3）酶反应条件温和、易操作、能耗低，还可避免因剧烈操作所造成营养成分的损失。因此，酶的应用正日益受到人们的重视［1］。 

酶的制备主要有2种方法，即直接提取法和微生物发酵生产法。早期的酶制剂是以动植物作为原料，从中直接提取的。由于动植物生长周期长，又受地理、气候和季节等因素的影响，因此原料的来源受到了限制，不适于大规模的工业生产。目前生产上应用的酶制剂中，虽然动、植物来源的酶制剂还在发挥着不可忽视的作用，占很少的一部分，但人们正越来越多地转向以微生物作为酶制备的主要来源，如淀粉酶和蛋白酶的微生物制备已经实现工业化。 

目前已经能够大规模工业化生产的100多种酶中，绝大部分都是通过微生物发酵生产的。现将部分典型菌种生产的酶制剂及其用途列于附表中。 附表 部分典型菌种生产的酶制剂及其用途 典型生产菌名称 酶名称 酶类型 用途 Bacillus subtilis 淀粉酶Amylase 水解酶 淀粉水解 Aspergillus niger 葡萄糖苷酶Amyloglucosidase 水解酶 葡萄糖生产 Streptomyces grisus 碱性蛋白酶Alkaline protease 水解酶 洗涤剂生产 Rhizopus japonicus 中性蛋白酶Protease 水解酶 洗涤剂生产 Bacillus subtilis 脂肪酶Lipase 水解酶 洗涤剂等生产 Trichoderma reesei 纤维素酶Cellulase 水解酶 纤维素水解等 Eriwinia carotovora 果胶酶Petinase 水解酶 食品加工等 Bacillus coagulans 葡萄糖异构酶Glucose isomerlase 异构酶 高果糖浆制造 Escherichia coli 青霉素酰化酶Penicillin acylase 转移酶 6-APA制造 

1 微生物制备复合酶制剂的发展 微生物酶的生产是1884年日本人Takamin首先开发的，其生产的酶应用范围限于作为消化剂、制革工业和棉布退浆剂等［2］。

20世纪40～50年代，酶作为添加剂开始用于动物饲料。

20世纪60年代，随着发酵技术和菌种选育技术的进步，日本酶法生产葡萄糖获得成功，欧洲加酶洗涤剂开始流行。20世纪70年代酶法生产果葡糖浆又获成功，这带动了淀粉深加工工业的兴起，工业酶开始大量需要，使酶制剂工业开始蓬勃发展，并逐渐引起了人们的广泛重视。

20世纪80年代以后，遗传工程被广泛用于产酶菌种之改良，酶制剂工业已成为一门重要的高科技产业［3］。 

同样的，复合酶制剂也是在饲用和洗涤剂中发展起来的。早期的复合酶制剂是通过单酶复配后再使用，近几年则转向微生物发酵直接生产复合酶制剂的研究。 据报道，黑曲霉可以产生19种酶，而产生α-淀粉酶的微生物则达到28种之多［4］。 

2 复合酶的微生物发酵方式［5-7］ 复合酶的生产主要通过以下3条途径：（1）单一酶复配；（2）产单一酶的多菌种混合发酵；（3）产多种酶的单一菌种发酵。单一酶复配法在洗涤剂工业中运用较成功，但购买单一成品酶成本太高不适于大规模的工业应用。多菌种混合发酵是一个生物混合体系，体系中的微生物之间大多具有生长代谢协调作用。目前，利用产多种酶的单菌种和多菌种混合发酵的研究较多。 

3 微生物制备复合酶制剂的影响因素 微生物酶的发酵生产是在人为控制的条件下有目的进行的，因此条件控制是决定酶制剂产量和质量的关键因素。优良菌种的筛选、培养基、碳源、氮源、无机盐类、生长因子和pH都是微生物发酵过程中需要控制的关键因素。 复合酶制剂的制备中，单菌种发酵生产多酶系，应考虑各酶系之间的相互作用，而在多菌种混合发酵中，多菌发酵是一个混合体系，则应兼顾各种菌种生长的相互关系。 

4 复合酶制剂的研究进展 用单一菌种生产多种酶的研究已有成功的例子，如王水顺等［8］经紫外线、紫外线和亚硝基胍复合诱变获得一株产酸性蛋白酶（酶活可达4525 U/g）、果胶酶（酶活可达7015 U/g）和纤维素酶（酶活可达4497 U/g）复合酶的菌株SL2111，并且对各种酶的相关性进行了研究，得出酸性蛋白酶酶活力与纤维素酶、果胶酶酶活力的变化呈正相关。施安辉等［9］诱变曲霉得到的一株纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶等酶活较高的菌株。 多菌群组合发酵产酶制剂的研究也不少。陈庆森等［10］通过对高产纤维素酶的绿色木霉TB9701和饲料酵母的多菌种混合发酵的正交试验结果的分析，优化出了几组微生物共发酵的最佳配伍方式和较切合实际的工艺条件。发酵液中玉米秸秆的纤维素的利用率达到了70％，粗蛋白质的得率在23％以上。张庆华等［11］报道了以产酶的酵母、芽孢杆菌或乳酸菌为配伍菌株，固态法生产具有较高酶活性的活菌制剂，获得了较好的两种菌的组合，并得出结论：双菌种互利共生，生长速度快，较好地抑制了杂菌的生长。彭爱铭等［12］研究了地衣芽孢杆菌TS-01和枯草芽孢杆菌TS-02在不同培养基时，单独培养和混合培养对酶系的影响。研究发现，两株菌的淀粉酶和蛋白酶分泌能力较强，而甘露聚糖酶和木聚糖酶活力较低，培养条件对酶活有一定影响。 可见，寻求多种酶高产量菌种的研究和多菌种混合发酵体系的建立是现在研究的热点。 

5 16Sr RNA菌种鉴定技术在复合酶制剂菌种筛选中的应用 酶产量高低的关键在于得到产酶性能优良的菌种，这也是发酵生产法的首要环节。菌种必须具有繁殖快、培养基成分经济、产酶性能稳定、酶粗品易于分离纯化等特性，而菌种的鉴定又是整个工作的开端。随着生物技术的飞速发展，微生物分类鉴定由传统的形态观察和理化性质实验发展为现代生物的16Sr RNA序列分析技术。16Sr RNA序列分析技术的基本原理就是从微生物样本中提取16Sr RNA的基因片段，通过克降、测序或酶切、探针杂交获得16Sr RNA序列信息，再与16Sr RNA数据库中的序列数据或其他数据进行比较，确定其在进化树中的位置，从而鉴定样本中可能存在的微生物种类［13］。这种方法克服了传统微生物培养方法的限制，操作方便、检测快速准确且灵敏度高，已被广泛应用到菌种鉴定、群落对比分析、群落中系统发育及种群多样性的评估等领域，是一种客观和可信度较高的分类方法［14］，在微生物菌种鉴定中起着巨大的作用。 随着基因工程与蛋白质工程的发展，原生质体融合技术，定向突变--即基因克隆技术开始应用于菌株选育，来提高酶的产量。R te Biesebeke等［15］对米曲霉（Aspergillus oryzae）进行突变以提高其固态发酵中淀粉酶、葡萄糖化酶和蛋白酶的产量，结果显示：突变后淀粉酶活力提高50％，葡萄糖化酶活力提高近100％，蛋白酶活力提高90％。 克隆酶的生产开始成为人们研究的热点，可以生产出人类所需要的符合设计方向的酶制剂，虽然其在开发时有较大的难度，但随着基因工程与蛋白质工程的发展，将会在复合酶制剂制备中得到更好的应用。 

6 结语 总之，微生物制备复合酶制剂已成为当前及今后酶制剂发展的方向，在各个行业中起到巨大的作用。只有不断寻找更多的适用的产酶菌种，研究选择适宜的发酵方式，充分利用混合发酵和复合酶的生产技术将是以后微生物制备酶制剂的发展方向，使更多的酶制剂实现工业化生产，以满足日益增长的酶制剂需求。