微生物多样性分析的常见问题

　　一般做二代测序（即扩增子测序）可以鉴定到属，三代一般是测菌的全长，信息量更多一些，有一些种属可以精确到种的信息，但是个别亲缘关系很近的，不一定能鉴别开。

　　1.微生物多样性是否能鉴定到菌株的种或者属？测全长和扩增子有什么区别？

　　一般做二代测序（即扩增子测序）可以鉴定到属，三代一般是测菌的全长，信息量更多一些，有一些种属可以精确到种的信息，但是个别亲缘关系很近的，不一定能鉴别开。 真菌、细菌、古菌全长引物包含区段引物序列（V3V4，IT1区等)，全长可以更准确的物种分类，更多的物种鉴定，能精确定位到“种”水平。 全长测序使用三代测序平台。基于PacBio 测序平台测序，相比较二代测序只选择 1-2 个高变区进行测序，三代可以获得全长的序列，更多变异区信息可以提高物种鉴定的分辨率，还可以提高对于群落组成的鉴定的精度，更加真实的还原样本中微生物群落结构。

　　2.16s扩增子测序和宏基因组的区别？

　　①普通16S扩增子测序： 一般是通过对16S V3或V4区（大概200-300bp）PCR扩增建库后，进行高通量测序，选择这两个区域的原因是可检测的物种多样性更丰富，并且可重复性强，二代测序的读长可达到500bp，检测结果无需拼接。缺点是由于序列长度有限，对样品的鉴定一般只能精确到属。 ②16S全长扩增子测序：16SrDNA的全长大约为1500bp，通常来说足够鉴定到种，其实现有两种方法：其一是通过二代测序，不同于V3V4区测序，16S全长超过了二代测序的有效读长，因此需要对结果进行拼接，此外，必须提高16S全长序列的质量，测序结果才能精确，因此对技术人员的操作要求也较高；其二是通过三代测序，它的优势是拥有超长的读长，16S全长测序结果无需拼接，其缺点就是错误率高，通量低，成本昂贵。 ③宏基因组测序：是对样本中全部基因进行测序注释，能鉴定微生物到种水平甚至菌株水平，宏基因组测序在16S测序分析的基础上还可以解释环境样本中的功能组成及代谢通路等信息，主要用于深入挖掘环境样本功能层面的信息。它的技术原理是将微生物基因组DNA随机打断成较小片段，然后在片段两端加入通用引物进行PCR扩增测序，再通过组装的方式，将小片段拼接成较长的序列，由于宏基因组测序结果数据量巨大，耗时更长，操作流程也更复杂，因此收费也更高。 一个细菌分类地位的最终确定，需要做多相分类分析，包括形态，生理生化，进化和分子等特征，以后还会包括基因组分析。16S的数据只是一个参考值。