微生物稀释平板计数、划线分离

一、目的要求

1. 学习平板菌落计数的基本原理和方法。

2. 熟练掌握倒平板技术、系列稀释原理及操作方法，平板涂布及划线分离方法。

二、基本原理

平板菌落计数法是根据微生物  在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的现象进行的，也就是说一个菌落即代表一个单细胞。计数时，先将待测样品作一系列稀释，再取一定量的稀释菌液接种到培养皿中，使其均匀分布于平皿中的培养基内，经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可换算出样品中的含菌数。

这种计数法的优点是能测出样品中的活菌数。此法常用于某些成品检定（如杀虫菌剂），生物制品检定以及食品、水源的污染程度的检定等。但平板菌落计数法的手续较繁，而且测定值常受各种因素的影响。

三、器材

大肠杆菌  悬液，牛肉膏蛋白胨培养基， 1ml无菌吸管，无菌平皿，盛有4． 5 ml无菌水的试管，试管架和记号笔等。

四、操作步骤

（一）稀释平板计数

1．编号：

取无菌平皿 9套，分别用记号笔标明10-4、10-5、10-6各3套。另取6支盛有4．5ml无菌水的试管，排列于试管架上，依次标明10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。

2．稀释

用1ml无菌吸管精确地吸取0．5ml大肠杆菌悬液放入10-1的试管中，注意吸管尖端不要碰到液面，以免吹出时，管内液体外溢。然后仍用此吸管将管内悬液来回吸吹三次，吸时伸入管底，吹时离开水面，使其混合均匀。另取一支吸管自10-1试管吸0．5ml放入10-2试管中，吸吹三次，……其余依次类推。

3．取样

用3支1ml无菌吸管分别精确地吸取10-4、10-5、10-6的稀释菌液0．2ml，对号放入编好号的无菌培养皿中。

4．倒平板

于上述盛有不同稀释度菌液的培养皿中，倒入溶化后冷却至45℃左右的肉膏蛋白胨琼脂  培养基约10—15ml，置水平位置，迅速旋动混匀，待凝固后，倒置于37℃温室中培养。