微生物酶的分离纯化技术

　　2.1 膜处理技术

　　微生物发酵液以横过膜表面的方式通过错流膜，液流清扫膜表面的溶质层，使溶质无法积聚在膜表面处，从而截留微生物细胞和浓缩含酶发酵液，从而达到分离纯化的目的。Sztajer等用毛细管超滤膜纯化Pseudomonas fluorescens脂肪酶，他们比较了2种毛细管超滤膜：内径1.1mm截断相对分子质量为10kDa的聚丙烯腈和聚砜。对PS而言，仅观察到浓缩效果，适合浓缩酶；而PAN除了浓缩，还除去杂蛋白可应用于初分离。

　　2.2 免疫亲和纯化技术

　　免疫亲和纯化技术是一种高效选择性的蛋白质纯化技术。通过一步纯化，纯化倍数可达1 000-10 000。免疫纯化技术大部分是应用单克隆抗体和多克隆抗体，选择性依赖于单克隆抗体对目标蛋白的特异性程度及对杂蛋白的影响。免疫亲和纯化具有以下特点：①抗体与其相应抗原结合具有高度亲和力和特异性，能大量分离天然状态或近似天然状态的抗原；②不是所有的抗体都适用于免疫亲和纯化，但一旦获得一种性能良好的抗体，纯化过程就很快速而且可靠；③可按照不同规模进行，半天内即可完成，而且可以获得其他层析法不可比拟的纯化效果；④经过简单的改进，免疫亲和法也可用于纯化针对不同抗原的特异性抗体。Bandmann等在所有突变体的N末端引入IgG结合位点，构建融合蛋白，利用IgG与靶位点特异性结合的免疫方法纯化了E. coli表达的脂肪酶突变体角质酶。

　　2.3 反胶束萃取技术

　　反胶束萃取是指当有机溶剂中加入的表面活性剂浓度超过其临界值时，表面活性剂在溶液中形成反胶束，非极性基团在外，极性基团则排列在内，形成一个极性核，此极性核具有溶解极性物质的能力，当含有此种反胶束的有机溶剂与蛋白的水溶液接触后，蛋白及其他亲水性的物质能够溶于极性核内部的水中，由于周围的水层和极性基团的保护，蛋白不与有机溶剂接触，从而不会造成失活，实现对蛋白质的萃取。

　　目前用于反胶束萃取常用的有机溶剂是异辛烷，反胶束萃取的表面活性剂主要是阴离子丁二酸-2-乙基己基酯磺酸钠和阳离子表面活性剂氯化三辛基甲基铵。为了进一步提高反胶束萃取分离的选择性，可在反胶束表面活性剂的烷基上连接对蛋白质具有生物专一性的配基，实现反胶束亲和萃取分离。