微生物鉴定技术贯穿食品安全始终

　　随着人们生活水平的不断提高，食品安全问题愈发受到重视，微生物对食品的污染问题也随之备受关注。微生物包括细菌、真菌等，有些微生物还是致病菌，对人体的危害很大，因此食品中微生物的检测非常重要。

　　微生物鉴定技术在检验检疫，食品、化妆品等产品致病菌的检测，动物源性致病菌的检测，植物病原细菌、真菌的检测等工作中起到非常关键的作用。

　　速度快取代耗时长

　　目前，微生物鉴定技术的发展方向有两个：速度快和分型能力强。速度快的微生物鉴定技术主要以飞行时间质谱鉴定技术为典型代表，可以在数十秒内实现微生物的鉴定；分型能力强的鉴定技术主要包括各种基于DNA的鉴定技术。

　　微生物鉴定技术主要有形态学观察、全自动微生物生化鉴定系统和依据细胞物质进行微生物鉴定技术等方法。

　　微生物的形态学观察，主要依据微生物的形态和生理生化反应等特征来进行微生物的分类和鉴定。用微生物的形态特征来鉴定微生物是由于微生物的形态比较单一，容易分辨；用微生物的生理生化反应特征来鉴定微生物主要是依据微生物细胞壁的组成、微生物发酵产物和微生物对碳源、氮源等养分的利用。

　　但是，这种方法相对比较烦琐、耗时，因此近年来被全自动微生物生化鉴定系统逐步替代。

　　全自动微生物生化鉴定系统实际上是将多个生化反应有效整合、浓缩于商业化的板卡上，方便实验室进行微生物的鉴定。该系统具有以下优点：第一，生化反应数量多，商业化的卡板最多可集合45~46种生化反应；第二，实验操作标准化，节省大量人工；第三，鉴定速度快，一般3~4小时即可出鉴定结果。

　　基于以上优点，目前，全自动微生物生化鉴定系统已经作为实验室中微生物的日常鉴定手段。除此之外，全自动微生物生化鉴定系统还具有细菌的MIC值测定和耐药表型的检测等作用。

　　依据细胞物质进行微生物鉴定技术主要包括蛋白质的检测和DNA的检测，是目前微生物鉴定技术的两个发展方向。依据蛋白质检测的鉴定技术，具有鉴定速度快的特点，主要检测仪器有飞行时间质谱。基于DNA检测的鉴定技术，对微生物的分型能力很强，该检测技术主要有16S rDNA（核糖体DNA）测序技术、PFGE（脉冲场凝胶电泳，一种分离大分子DNA的方法）和全基因组测序技术等。

　　在蛋白质检测方面，利用飞行时间质谱进行微生物鉴定的原理是通过质谱获得微生物特征蛋白质分子的“指纹图谱”，然后与大容量的数据库进行对比，最终实现菌落或者菌株水平上的鉴定。质谱鉴定系统的优势主要体现在鉴定速度快，仅需十余秒即可完成。

　　在DNA检测技术方面，16S rDNA基因是细菌核糖体DNA的一部分，被称为细菌的“活化石”，该基因进化速度十分缓慢，具有生物钟的特点，已经作为细菌系统发育的目的基因，16S rDNA序列测定是科研领域细菌分类和鉴定的金标准。

　　根据实际情况选择合适的鉴定方法

　　目前，常见的商业化测序系统有针对细菌16S rDNA中的500bp保守序列进行测序、针对真菌的28S rDNA的D2基因区域进行测序等。该方法获得的数据有利于致病菌的溯源分析，但是操作过程具有一定的复杂度，耗时较长。另外，基因测序仪和测序耗材试剂的价格较贵，因此不利于在应用层面进行推广。

　　脉冲场凝胶电泳（PFGE）是一种分离大分子DNA的方法。此种方法的原理是将细菌包埋于琼脂块中，用适当的内切酶在原位对整个细胞染色体进行酶切，酶切片段在特定的电泳系统中通过电场方向的不断交替变换和适合的脉冲时间等条件作用而得到良好分离的方法。

　　PFGE的分型能力极强，可区分菌株水平的差异，目前被全世界各个国家普遍使用。通过PFGE分型可以对细菌性传染病、食源性致病菌进行监测，同时可以进行分子流行病学的调查，但是操作较为烦琐，需要较高的实验技能方可掌握。

　　全基因组测序技术可以对菌株进行最为有效的分型，即使是16S差异不大的菌株，也可以通过分布在整个基因组上的单核苷酸多态性位点进行区分，是目前分型能力最为强大的技术之一。但全基因组测序用于微生物鉴定工作的主要障碍在于使用成本高和专业的数据分析。

　　对于检验检疫工作来说，需要根据实际情况选择合适的微生物鉴定方法。同时，为了更快速、更准确地确认病原微生物，可能需要几种鉴定方法联合使用，例如可以先利用质谱鉴定速度快的优势迅速判断致病菌，然后再利用分子生物学的手段进行分型和流行病学的调查。

　　（作者曾静,系北京市出入境检验检疫局微生物实验室主任）