1、应用范围
此ELISA试剂盒可用于人血清中抗肺炎支原体IgM抗体的体外定性和定量检测。
2、前言说明
除病毒、冠状病毒、流感病毒、副流感病毒或腺病毒外，肺炎支原体也是传统感冒的致病因子。支原体属于柔膜体纲。其六个真菌属的共有特征是没有细菌细胞避，渗透能力差，体积小。与革兰氏阳性和革兰氏阴性菌相比，其基因组明显更小。它们依靠宿主细胞而生长，个别如寄生虫一样依靠宿主有机体而生长。肺炎支原体是一种引起气管支气管炎和原发性非典型肺炎的致病菌。肺炎支原体感染通常可伴随有续发性疾病，如梗塞、脑炎、慢性神经病和格林-巴利综合征（GBS）。在实验室内，除冷凝集实验和补体结合实验外，ELISA是一种灵敏度较高而且可区分不同免疫球蛋白的可选方法。在急性感染中，特异性IgA抗体比IgM产生得更有规律、更快。IgA浓度减少的时间比IgM要早，或是说比后来的IgG增加反应要早。各种各样的研究都表明，肺炎支原体三种免疫球蛋白的检测对监测其临床发展进程是非常有必要的。
3、实验原理
此固相ELISA试剂盒利用的是夹心法。包被孔内包被了抗原，用对人IgM有特异性的酶标抗体来检测样品中的特异性抗体（此抗体可结合到包被抗原上）。底物反应后，所显示的颜色的强度与检测到的IgM特异性抗体的量正比。样品的结果可直接用标准曲线获得。
4、试剂盒组成：
4×2ml | 标准品A-D | 1；10；35；125U/mL，待用 标准品A=阴性质控 标准品B=临界质控 标准品C=弱阳性质控 标准品D=阳性质控 内含抗支原体的IgM抗体，PBS（磷酸缓冲液），稳定剂。 |
1×14ml | 酶标IgM | 红色，待用。内含过氧酶标记的抗人IgM，蛋白缓冲液，稳定剂。 |
1×12×8 | 包被板 | 可拆，包被有特异性抗原。 |
1×14ml | TMB底物液 | 含TMB |
1×14ml | TMB终止液 | 0.5M的H2SO4 |
1×60ml | 稀释液 | 含PBS缓冲液，＜0.1%NaN3 |
1×60ml | 浓缩洗涤液 | 浓缩型（10×），含PBS缓冲液，吐温20 |
2× | 粘性金属板 | 用于在温育时遮盖包被板 |
1× | 塑料袋 | 用于储存不用的板条 |
5、实验所需材料但试剂盒不提供
1) RF吸附剂
2) 移液器，体积：5；50；100；500 µL
3) 校准仪
4) 样品稀释用试管（1ml）
5) 带试剂储器8道移液器
6) 洗涤瓶，自动或半自动洗板机
7) 能在450nm处读数的酶标仪
8) 双蒸水或去离子水
9) 吸水纸，取样吸头和计时器
6、实验前的准备说明
6.1成分准备
稀释/溶解 | 成分 | 稀释液 | 比例 | 备注 | 贮存 | 稳定性 | |
60ml | 洗涤液 | 加600ml | 双蒸水 | 1：10 | 加热至37°C以溶解结晶，充分混合 | 2-8°C
| 8周 |
6.2样品稀释
样品 | 稀释 | 稀释液 | 比例 | 备注 |
血清/血浆 | 全部稀释 | 稀释缓冲液 | 1：101 | 例：5µL+500µL |
6.3用RF吸附剂处理：
注意 | 为了避免特异性IgG和类风湿因子的干扰，病人的血清应当用RF吸附剂处理(RE59059)。 标准品和质控品千万不要用RF吸附剂处理。 |
1. | 在400µL按1：101的比例稀释的样品中加入20µL RF吸附剂。充分混合。 |
2. | 室温（18-25℃）下温育≥1min（＜15min） |
为了避免吸附特异性抗体，应当避免温育时间＞15min。
预处理的样品可能会是浑浊的。
7、实验步骤：
1) 加100µL标准品和已稀释样本于相应反应孔中，在定性检测中只使用标准品B。
2) 封板后室温（18℃-25℃）温育60分钟。
3) 移去粘性金属板，弃去孔中液体。用300µL洗涤液洗板3次，在吸水纸上拍干。
4) 在每一微孔中加入100µL酶联物。
5) 封板后室温（18℃-25℃）温育30分钟。
6) 移去粘性金属板，弃去孔中液体。用300µL洗涤液洗板3次，在吸水纸上拍干。加底物液和终止液时，如果有条件的话，可使用8孔微量移液器。确保底物液和终止液都是相同的时间间隔加入。使用确切容积并避免气泡产生。
7) 每孔加TMB底物液100µL。
8) 室温（18℃-25℃）避光温育20分钟。
9) 在每一微孔中加入100µLTMB终止液以终止底物反应。轻轻摇动包被板以使试剂混合均匀。此时，颜色蓝色变成黄色。
10) 加终止液后60分钟内在450nm（参考波长：600-650nm）处测OD值。
8、结果计算
在半对数坐标纸上或用自动生成的方法，以标准品的OD值为Y轴，浓度为X轴，绘制一标准曲线图。用立体图、4参数对数图或对数-对数图都可获得良好的实验结果。对于标准曲线图，用标准品的每一单值进行计算（样品结果明显异常的值必须删除掉，应使用更加合理的单值）。样品的浓度可直接从标准曲线上获得。一旦样品稀释了，就应当乘以相应的稀释因子。如果样品所测得的浓度高于最高标准，则应根据实验前的准备说明所述对样品进行稀释，并重新检测。
9、结果判定：
＞ 12 U/ml 为阳性
8 - 12 U/ml 为可疑
＜ 8 U/ml 为阴性
此检测结果并不是任何治疗结果判定的唯一因素，它应当结合临床观察和诊断结果加以判断。
本译文仅供参考，详情请以原文为准。