总细胞RNA的提取方法

实验概要

总细胞RNA的提取在建库过程中，由于cDNA合成这一步将使用通用引物oligo dT，因此在总RNA提取这一步中，提取纯化mRNA不是非常必要的。提取高纯度的总细胞RNA足可以被用作cDNA合成的模板，目前提取RNA的方法很多，也有不少商业化的试剂盒。

实验步骤

1. TRIZOL法

   1) 在制备的带有细胞沉淀的Eppendorf管中加入1ml TRIZOL溶液，用手反复摇匀至细胞碎块完全被裂解，如不易完全裂解，可用移液器带有1ml无菌吸头反复吹打、研磨，至组织细胞完全裂解，液体基本澄清为止，必要情况下，可再次加入少许TRIZOL溶液。

   2) 将上述Eppendorf管置室温(25~27℃)静置15~20min后(也可置4℃较长时间)，每管加入0.2ml氯仿(0.2ml/ml)，在手中反复振荡摇匀，室温静置10min。

   3) 将Eppendorf管置于高速台式冷冻离心机，或将普通离心机事先置4℃冰箱预冷。在4℃ 12 000r/min离心10min。

   4) 小心吸取上层水相置于另一无菌的新的Eppendorf管中，内含有提取的细胞总RNA。

   5) 于管中加入0.5ml异丙醇，室温沉淀10min或4℃沉淀30min至1h。

   6) 4℃ 12 000r/min离心10min，弃上清，沉淀用75%无水乙醇洗两次。

   7) 最后让沉淀的RNA在室温自然干燥，切勿抽干。

   8) 每管用8~10μl无RNAase的纯水重悬干燥后的RNA，置于冰浴立即用于cDNA合成或置-70℃长期保存。

2. 标准RNA分离试剂盒(standard RNA isolation Kit)法

   1) 在变性的异硫氢酸胍(guanidinium isothiocyonate)溶液中(溶液D)加入0.1ml二巯基乙醇最终至14ml变性溶液。

   2) 加入1ml溶液D至Eppendorf管中沉淀细胞(约10⁷细胞)，悬起沉淀，使细胞碎片裂解。

   3) 加入0.1ml 2mol/L pH值4.0醋酸钠，混匀，分成两小管。

   4) 每管中加入0.5ml水饱和酚，充分混匀。

   5) 每管加入1ml氯仿异戊醇溶液，混匀10s。置冰浴15min，如果未形成两层，另加入0.5~1ml氯仿异戊醇溶液。

   6) 置4℃，12 000r/min离心至少20min。

   7) 将上层水相转移至一新鲜Eppendorf管中，加等量异丙醇，置-20℃沉淀1h。

   8) 12 000r/min 4℃离心20min，沉淀RNA。

   9) 重悬RNA沉淀于0.5ml溶液D中。

   10) 加05ml异丙醇混合摇匀，存放-20℃备用。

   11) 临用前12 000r/min 4℃离心沉淀，用75%乙醇洗一次。

   12) 室温自然干燥沉淀的RNA，切勿过于干燥。

   13) 重悬于50μl无RNA酶的纯水中。

   14) 检测RNA纯度和浓度：260/280nm吸收浓度比值需1.8。如果比值过低，表明有蛋白质或酚污染。RNA浓度(μg/ml)=260nm吸收值×稀释度×40。

一般免疫后的鼠脾脏，可获总量30~50μg RNA，人外围血则少些，RNA总量约为20~30μg/50ml外周血。