恒远技术分享:细胞的冻存与复苏

 适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。除此之外，还可以利用细胞冻存的形式来购买、寄赠、交换和运送某些细胞。今天的技术文章中就为大家讲解一下细胞的冻存与复苏操作方法！

操作步骤

（一）细胞冻存

     1. 配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液；

     2. 取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中；

     3. 离心1000rpm，5min；

     4. 去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的终密度为5×106/ml～1×107/ml；

     5. 将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml；

     6. 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；

     7. 冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/ min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h ，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。

（二） 细胞复苏

      1.将冷冻管从液氮中取出，迅速投入37℃水浴融化，细胞融化后要尽快(约1min)移出37℃水浴。37℃水浴时间延长会提高细胞死亡率，复苏过程中一般细胞死亡率在20%～25%之间。

      2.迅速用酒精棉球擦拭冷冻管外部杀菌消毒，然后放置在冰浴上。

      3.小心开启瓶盖，把细胞转入含有4mL培养基的培养瓶中，然后把培养瓶移至培养箱，26℃～28℃培养1h，让细胞贴壁。

      4.细胞贴壁后，小心移弃培养基，主要是去掉DMSO(悬浮生长细胞要通过离心沉淀除去DMSO)、死细胞及其碎片，加5mL新鲜培养基，26℃～28℃培养。

      5.细胞培养24h后，更换新鲜培养基，继续培养直到形成单层，便可以传代。

      6.详细记录复苏细胞的名称、数量、复苏时间、存放部位等。