土壤农杆菌LBA4404菌株

YEB液体培养基 酵母提取物 牛肉膏 蛋白胨 蔗糖 硫酸镁 氯化钙 利福平储液

超净工作台 恒温摇床 冷冻高速离心机 高压灭菌锅 冰箱 超低温冰柜 分光光度计 接种针 试管 离心管 离心管 冰浴 微量进样器 吸头

一、实验仪器、材料和试剂

1.  仪器

超净工作台，恒温摇床，冷冻高速离心机，高压灭菌锅，冰箱，-70℃超低温冰柜，分光光度计，接种针，10ml试管，50ml离心管，1.5ml离心管，冰浴，微量进样器及吸头。

以上玻璃仪器和离心管需在用前灭菌，灭菌条件：120℃，15分钟。

2.  材料

土壤农杆菌LBA4404菌株或其它农杆菌菌株

3.  试剂

（1）YEB液体培养基（1 L）：酵母提取物1 g，牛肉膏5 g，蛋白胨5 g，蔗糖5 g，MgSO₄·7H₂O 0.5 g，pH7.0，高压灭菌。

（2）利福平（Rif）储液：50 mg/ml

（3）20 mM CaCl₂，高压灭菌。

二、实验步骤

1.  挑取根癌农杆菌LBA4404单菌落于3 ml的YEB液体培养基（含Rif 50 mg/l）中，28℃振荡培养过夜。

2.  取过夜培养菌液1 ml接种于50 ml YEB（Rif 50 mg/l）液体培养基中，28℃振荡培养至OD₆₀₀为0.5。

3.  取2 ml菌液，13 000 rpm，离心30 sec，弃上清。

4、加入1000 μl 20 mM CaCl₂，使农杆菌细胞充分悬浮，冰浴30 min。

5、13 000 rpm，离心30 sec，弃上清，置于冰上，加入500 μl预冷的20 mM CaCl₂，充分悬浮细胞，冰浴中保存，24 hr内使用，或液氮中速冻1 min，置-70℃保存备用。