戊二醛二步交联法制备酶标抗体

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戊二醛连接反应

戊二醛（glutaraldehyde，GA）：是一种常用的同型双功能交联剂，它的两个醛基可分别与HRP和抗体蛋白的氨基形成Schiff碱（-N=C-），将他们以五碳桥连接起来。

戊二醛连接反应是最温和的交联反应之一。可在4-40℃范围，pH6.0-8.0的缓冲液中进行。另外，GA缩合体使被结合的蛋白分子与分子之间的间隔延长，可免于使蛋白分子的三级结构发生改变。

操作步骤

1. 用0.05mol/L， PH9.5碳酸盐缓冲液(CBS)将25%戊二醛稀释至5%；

2. 称取5mgHRP 溶于0.5ml 5%戊二醛，37℃水浴结合2h；

3. 加入220.0g/L NaCl 0.1ml， 充分混匀后，置4℃10min预冷；

4. 加冷无水乙醇2.4ml，颠倒混合，立即1000r/min离心10min；

5. 弃上清，沉淀用冷80%乙醇洗一次，将离心管倒置，控干；

6. 加入0.05mol/L， PH9.5 CBS 0.5ml溶解沉淀物；

7. 将5mg抗体溶于0.5ml 0.15mol/L NaCl，再与醛化HRP溶液混合；

8. 加入1.0mol/L， pH9.5 CBS，调节pH值至9.0-9.5；

9. 于4℃，电磁搅拌下结合24h；

10. 加入0.1ml O.2mol/L赖氨酸，以封闭残留的醛基，终止反应；

11. 4℃放置2h；

12. 将反应物通过Sephadex G-200凝胶柱，用PBS洗脱，收集第一洗脱峰；或将反应物装入透析袋，对0.01mol/L，pH7.2 PBS，4℃透析过夜并收集； 即为酶标记抗体。

注意事项

1. 所用的戊二醛A235/A280为10左右，未经蒸馏等处理。

2. 酶的醛化时间37℃2h、4h和4℃16h无明显区别。

3. 醛化时，使用的缓冲液以CBS为宜。

4. 加入220.0g/L NaCl 的目的主要是提高离子强度，以便乙醇沉淀。

5. 根据有关文献的报道，用50%饱和硫酸铵盐析或Sephadex G-200凝胶柱层析，对于ELISA检测并无实际意义，并常使酶与抗体的活性大量丧失，且这两种纯化法不能去除未标记的抗体，需用ConA-Sepharose 4B纯化才能达到，因此，在常规工作中，盐析和过柱的纯化步骤可以省