成年猪胰岛分离纯化方法的优化

实验概要

本实验的目的是改良成年猪胰岛分离纯化技术，以优化胰岛制备方法。方法采用体、尾部区段猪胰腺胰管内灌注复合胶原酶震荡消化(胶原酶V加DNA酶)和改进的Dextran不连续密度梯度离心法分离纯化猪胰岛，并进行生物学活性测定和形态学观察。

主要试剂

胶原酶V，512 kut/mg(Sigma公司)，DNA酶(Sigma公司)，胎牛血清(Gibco公司)，RPMI1640培养液(Gibco公司)，Dextran(Pharmacia公司)，Hanks平衡盐溶液(Gibco公司)。

主要设备

离心机，注射器，显微镜，超净工作台等。

实验材料

成年杂种猪，猪龄12 mo，体质量150 kg左右，猪被屠宰放血后，在相对无菌条件下迅速取出胰腺，保存于4℃ Hanks液中送至实验室，热缺血时间少于10 min，冷缺血时间少于90 min。

实验步骤

1. 胰岛分离

胰腺取回后，置于超净工作台上，快速去除胰周组织、脂肪、血管及外科被膜，保留固有被膜。从胰头、胰体交界部横断胰腺，找到主胰管，用20 G套管针插入，缝合线结扎，尾部远端亦结扎切断，每次均取约15-20 g组织，注入4℃含Ca²  Hanks液配制的复合胶原酶溶液(1.5  g/L，内含DNA酶0.3 g/L)，注入量 = 胰质量×2，注射速度7 mL/min，3-4  min内完成，置入玻璃容器内，在38.5±0.1℃水浴中震荡消化，震速100 r/min，在消化过程中间断加入0.1  mmol/L的NaOH，使消化液pH值尽可能维持在7.8左右，从消化20 min开始每间隔4  min取样一次，双硫腙染色镜检，当胰腺组织被消化裂解成细沙状，镜检见大部分结构完整的胰岛从外分泌组织中脱落出来，立即用4℃冷Hanks液(含100   mL/L胎牛血清)终止消化，充分混匀后，用40目钢网过滤，收集消化后组织，4℃离心冼涤2次，去除脂肪等杂质细胞，取样镜检计数和观察消化后胰岛分离情况。
2. 胰岛纯化

用Dextran配制成密度为1.037，1.054，1.070，1.096，1.11  kg/L的不连续密度梯度液，依次将不连续密度梯度液各10 mL加入50 mL离心管中，最后将洗涤后的消化组织每0.5 mL与1.037  kg/L密度梯度液10 mL混匀，小心移至离心管中液体上层，形成不连续密度梯度。将2-4个离心管置入低温离心机中，先800 r/min离心5  min，然后2 500 r/min离心15 min，离心后在1.096-1.054  kg/L之间收集纯化的胰岛，4℃离心洗涤2次。分别取样镜检计数，估计纯度和行生物学活性及组织学鉴定。
3. 胰岛计数和纯度测定

分离纯化后的组织悬液用双硫腙(双硫腙10  mg，无水乙醇3 mL，250 g/L氨水50  mL)进行染色，光镜下胰岛细胞团染成腥红色或红色，外分泌组织不着色，呈圆形、椭圆形或不规则形.在显微镜下计数直径≥50  mm的胰岛算出每克胰腺组织分离的胰岛当量数，纯度用内、外分泌组织量的比值来估计。
4. 胰岛生物学活性鉴定

将纯化后胰岛细胞悬液放置在显微镜下，用巴氏吸管吸取胰岛放入培养板中，每10个胰岛当量(每1个胰岛当量相当于直径150  mm的胰岛细胞团，IE)的成年猪胰岛(APIs)置入一个培养孔，6孔为1组，共4组.每组分别置入无糖培养基、含5.6  mmoL/L葡萄糖(低糖)、16.7 mmoL/L葡萄糖(高糖)、16.7 mmoL/L葡萄糖加10 mmoL/L茶碱(高糖  茶碱)的RPMI1640培养液中，置于37℃、含50 mL/L CO₂的培养箱中孵育4 h，收集培养液，用胰岛素放免试剂盒(中科院原子能研究所)测定胰岛素含量.
5. 胰岛组织学检查

离心纯化后胰岛细胞悬液，收集胰岛组织，用无水酒精固定，石蜡包埋切片，HE染色检查胰岛组织结构完整性。
6. 统计学处理

所得数据以mean±SD表示，组间均数差异用t检验比较，P<0.05为有差异。