成纤维细胞的分离技术

实验概要

本实验分离了成纤维细胞，所述的通用操作方案适用于小鼠、大鼠、仓鼠和鸡胚胎。

实验步骤

选择大约一半足孕时间的胚胎最好，10-13天龄胚胎含有最大数量的未分化的间质细胞，成纤维细胞可从这些细胞衍生获得。
1. 胚胎的分离

   1) 适用哺乳动物（仓鼠、小鼠和大鼠）
   a.采用认可的方案处死啮齿动物
   b. 立即在无菌超净台内用70%乙醇擦洗整个动物。若可能，置紫外灯下照射5min。
   c. 用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后退。
   d. 用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，去除含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。
   e. 剔除胚胎周围的包膜，将胚胎放于无菌的含有无菌PBS的烧瓶中。
   f. 漂洗胚胎，去掉PBS。继续用PBS漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。

   2) 适用鸡胚胎
   a. 用70%乙醇擦洗鸡蛋壳。
   b. 用无菌剪刀轻敲鸡蛋的圆端，轻轻去除蛋壳露出气囊。
   c. 用无菌镊子去除覆盖于绒毛尿囊上的白膜。
   d. 剪开包膜，用弯镊夹住胚胎颈部去除胚胎。
   e. 弃头部，将无头的胚胎置于广口烧杯中，用PBS漂洗。

2. 将6-8个胚胎转移至一个小的无菌广口烧杯中，用新的无菌剪刀小心地绞碎胚胎，用PBS漂洗。
3. 在无菌状态下，将绞碎的胚胎转移于一500ml的无菌的有搅拌棒的烧杯中，加入200-300ml用HBSS配制的0.25%的无菌胰蛋白酶。
4. 在温暖的环境中或置于37℃培养箱中轻轻搅动15min。
5. 让存留的组织块在重力作用下慢慢沉降，将含有悬浮细胞的液体转移至一无菌大容积的离心管中，该管内按照每10ml上清加入1ml牛血清的比例加入牛血清以灭火胰蛋白酶。
6. 加入新鲜胰蛋白酶溶液（见前述步骤）于含有残留未消化组织块的500ml烧杯中，重复步骤4和5。
7. 离心混合的细胞悬液，1200r/min，5min，弃上清。
8. 用新鲜的无菌PBS重悬沉淀的细胞，按步骤7再次离心。
9. 用PBS反复洗涤细胞直至上清清亮为止。
10. 用含有10%牛血清和抗生素（如青霉素、链霉素）的DMEM 10ml再悬沉淀，并使终体积为100ml。
11. 让残留的大块未破碎的组织或特殊颗粒物质沉降。可采用数层无菌纱布过滤细胞悬液以去除任何残留的细胞快。
12. 为确定现有细胞浓度，加入0.2ml细胞悬液于1.8ml 1%醋酸溶液中以裂解红细胞，用血细胞计数器进行细胞计数。
13. 按每10mm平皿1*10⁷至4*10⁷细胞的数量接种于10ml组织培养液中，在饱和湿度的37℃ CO₂培养箱中孵育直至细胞铺满。
14当细胞长满后，去除培养液，用10%的温暖的Versene（用PBS配制的0.53nmol/L EDTA），洗涤细胞层2次。
15. 弃Versene，加入相同体积的温暖0.05%胰蛋白酶-EDTA。
16. 37℃孵育5min。
17. 用无菌吸管轻轻吹散细胞，并转移至一含有1-2ml牛血清的无菌管中。牛血清的终浓度约为10%，起到中和胰蛋白酶的作用。
18. 离心，1200r/min，5min，弃上清。
19. 再悬沉淀于5ml培养液中，另加入15ml培养液，分装于2个100mm平皿中。
20. 置37℃饱和湿度的CO₂培养箱中培养细胞，直至细胞长满，继续步骤14-20以传代细胞。