成骨细胞原代培养实验

采用植块培养方法时，用少量培养液孵育，使骨组织块贴附于培养瓶。骨组织块浮起后观察细胞长出情况。采用分离细胞的单层培养方法时，将松质骨切成 2~5 mm 大小，用胶原蛋白酶和胰蛋白酶消化。将混悬的细胞接种于培养瓶，用 F12 培养液培养。 

骨标本

Hams F12 培养液用于细胞传代的胰蛋白酶液分离成骨细胞的消化液

Petri培养皿培养瓶手术刀手术镊

一、外植块培养

1. 从手术室获得骨标本。

2. 在室温条件下，用无菌生理盐水浸洗骨组织数次。

3. 如果骨组织不能及时使用，将骨标本放入含有 12% FBS、青霉素和硫酸链霉素的 Ham’s  F12 （添加 12 % FBS、2.3 mmol/L Mg^2＋、100 U/ml 青霉素和 100 ug/ml 硫酸链霉素）培养液中。骨标本可在 4℃条件下储存过夜。

4 . 次日早晨，用含有 100 U/ml 青霉素和 100 ug/ml 硫酸链霉素的 Tyrode 液浸洗骨组织。

5. 将骨组织放入 Petri 培养皿，用手术刀和手术镊取骨小梁，然后将骨小梁移入另一个 Petri 培养皿。

6. 加入 10 ml Tymde 液，淹盖切除的骨小梁。用 Tyrode 液浸洗骨小梁数次，直至除去血液和脂肪细胞。

7. 为了进行植块培养，将 2 ml 完全培养液放入 25 cm² 培养瓶，预孵育 20 min，以便用培养箱内的气体平衡培养液。根据需要，用 CO₂、4.5% NaHCO₃ 或 HCl 调整 pH 。

8. 将骨小梁切成 1~3 mm 小块。

9. 吸去培养瓶内的预孵育培养液，然后加入 2.5 ml 新鲜的 Ham's F12培养液。

10. 将 25~40 块骨小梁放入培养瓶。

11. 将培养瓶直立，用接种环沿着培养瓶底壁滑动植块，使植块均匀分布。

12. 在 37℃条件下，将培养瓶直立放置 15 min。

13. 慢慢地使培养瓶恢复为正常的横置位。植块黏附于培养瓶底壁。

14. 在37℃ 条件下，将培养瓶横置 5~7 d。此后，检査细胞长出情况，换培养液。为了预防植块脱离，在将培养瓶从培养箱移于超净工作台内或显微镜上之前，将培养瓶慢慢地直立起来。

15. 每周换培养液 2 次，以维持培养。

16. 细胞生长形成单层时，取出植块，用胰蛋白酶（将 125 mg 胰蛋白酶（XI型，Sigma）溶入 50 ml 不含 Ca^2＋ 和 Mg^2＋ 的 Tyrode 液。调整 pH 至 7.0，过滤除菌。用 Pyrex 管分装成 5 ml 和 10 ml，在 -20℃ 条件下储藏）消化细胞。通过离心分离细胞，然后将细胞接种于培养瓶或培养皿。

二、分离细胞的单层培养

1. 用 Tymde 液反复冲洗松质骨，洗去脂肪和血细胞。在无菌条件下，用手术刀和手术镊切除骨小梁。

2. 取到较多的骨小梁后，用 Tyrode 液浸洗 3 次，洗去遗留的血液和脂肪细胞。将骨小梁切成 2~5 mm 小块。

3. 用含有 FCS 的 F12 培养液洗骨小梁块。

4. 将组织块放人盛有磁力搅拌棒的无菌小瓶内，然后加入 4 ml 消化液（分离成骨细胞的消化液：① A 液：含有 8.0 g NaCl、0.2 g KCl 和 0.05 g NaH₂PO₄ H₂O，用 100 ml 超纯水配制。②B 液（胶原蛋白酶和胰蛋白酶混合液）：将 137 mg 胶原蛋白酶（Ⅰ 型，Worthington Biochemicals）和 50 mg 胰蛋白酶（Ⅲ，Sigma）溶入 10 ml A 液。调整 pH 至 7.2，然后用超纯水配成 100 ml。过滤除菌后，分装成 10 ml，在 -20℃ 条件下储藏）。加入的消化液应淹盖组织块。

5. 在室温条件下，将含有组织块的液体搅拌 45 min。

6. 弃去细胞悬液，因为这些细胞中很可能含有成纤维细胞。

7. 加入 4 ml 消化液，在室温条件下搅拌 30 min。

8. 收集消化液，在室温条件下离心（580 g，2 min）。

9. 吸去上清液后，用 4 ml 含有 20 % FCS 的 Ham F12培养液混悬细胞，计数细胞。

10. 将细胞悬液离心（580 g，10 min）后，用 4 ml 完全培养液混悬细胞。将此细胞悬液作为接种物。

11. 将 75 cm² 培养瓶用 8 ml 完全 F12 培养液预孵育 20 min，以便用培养箱内的气体平衡培养液。

12. 吸去预孵育培养液，然后加入 2 ml 完全F12培养液。

13. 加入 4 ml 细胞悬液，接种密度为 6000~10000 个/cm²。

14. 最后加入 6 ml F12培养液，使总量成为 12 ml。

15. 在分离细胞期间，向剩余的骨组织块加入 4 ml 消化液，重复消化 30 min 。

收集分离下来的细胞。如有必要，重复消化几次。骨组织多时，消化时间可延长至 1~3 h 。每次消化后计数细胞，将分离的细胞分别接种于培养瓶。

细胞传代

1. 取出植入的组织块。

2. 吸去培养液，用 D-PBSA （0.2 ml/cm²）浸洗细胞。

3. 向培养瓶加入胰蛋白酶液（0.1 ml/cm²），在 37℃ 条件下孵育，直至细胞脱离瓶壁，且细胞彼此分离。用显微镜观察细胞的脱离和分离。一般孵育 10 min 即可。

4. 将分离的细胞移入离心管，然后加入等量含有 20% FCS 的 Ham F12 培养液。

5. 离心（600 g，5 min）。

6 . 吸去上清液，用完全培养液轻轻混悬细胞，反复吹打。

7 . 留两份细胞份用于确定细胞密度，另一份用于 DNA 检测。

8. 将剩余的细胞接种于先前用培养液平衡的培养瓶或培养皿。细胞可在 24 h 内贴壁。

1、实验材料要新鲜，从活体分离材料后要低温保存，并尽快进行细胞分离实验。

2、无菌操作。操作时用的培养液，可加平时细胞培养液5倍含量的青链霉素。

3、用酶法分离细胞时，注意酶液的浓度和控制消化时间。

贴块法分离细胞时，注意动作要轻柔，不要伤到细胞组织，组织块边缘尽量平整有利于细胞游离。

4、培养液的选择。不同的细胞有对培养液中营养的要求不同，根据所分离细胞的特性选择。