打通菌群多样性与功能的研究策略

近几年，肠道微生物可以说是最热的研究热点，频繁登上在CNS期刊的封面，不仅相关主题的学术论文表现强势，而且国自然资助的肠道微生物项目数也呈显著增长的趋势，其中2018年一共资助了近180项研究，资助金额高达7600万。由此可见肠道微生物一直是科研领域的研究热点，相信2019年肠道微生物仍是国自然申请的热点。总之，紧跟这个热点，不仅容易发文、发好文，申请基金也更加容易。

现有常用研究策略的不足

16S测序或宏基因是最常用的肠道微生物研究手段，主要侧重研究肠道微生物的多样性与生理、疾病之间的相关性。尽管这样的研究方法能够有助于了解生物过程中的菌群迁移情况以及找出潜在的参与疾病发生的菌株，在此基础上可进一步借助动物模型采用粪便移植或者特定菌株的灌胃实验等技术，可以相对直接地揭示肠道微生物或特定菌株与疾病之间的因果关系，但是对菌的功能与作用机制却知之甚少，也就是说仅仅采用16S测序或宏基因测序难以实现对菌群功能的探究。因此，从国自然申请标书的研究方案完整性与创新性上来看，这是需要大家关注的问题。

肠道菌群功能研究的切入点

目前大量研究发现肠道微生物对食物或外源性物质代谢过程中产生的一些小分子是有功能和活性的，如SCFAs，胆汁酸，TMA/TMAO，神经递质，氨基酸等物质对肠上皮组织乃至整个机体的物质代谢、免疫调节以及中枢神经系统的调节发挥着重要的作用。肠道菌群正是通过这些活性小分子与宿主进行相互作用的。因此为了更好的理解肠道微生物-宿主之间的相互作用关系，不仅需要了解肠道菌群的多样性变化，还需要进一步研究肠道菌群功能的变化，即对肠道菌群代谢产物的变化进行研究。所以如果从代谢物作为菌群功能研究的切入角度，相信会给申请国自然的项目的完整性、创新性加分不少。

打通多样性+功能的研究策略——16S+代谢组

菌群的多样性分析最常用的方法是采用16S rDNA扩增子测序方法（以下简称16S），其低成本快速高效，且方法成熟。而菌群功能则可以通过代谢组学对菌群相关的代谢产物进行系统性地检测。代谢组学是基于高通量分析和生物信息学技术，一种用于研究内源性小分子的组学技术，能够客观地检测菌群代谢产物，清晰的反映肠道菌群“功能”在特定条件下的变化。（如果前期没有关注特别关注的代谢物，可以选择非靶向代谢组学进行大规模筛选，如果有特定关注的代谢物，则可以选择靶向代谢组学。）16S与代谢组学相结合，打通肠道群菌“多样性”与“功能”，是最具有生物学联系的两个层面的联合，有助于全面探索肠道菌群与疾病发生、药物代谢/药效关系。

正是因为16S+代谢能够研究得更加深入和完整，所以近2年不少高水平文章都是采用这样的研究套路，甚至还有不少文章仅是补了个代谢实验，拿以前16S的数据又再发表了一篇文章。

16S+代谢联合分析的关键——代谢组学

16S+代谢联合分析能否做得好，更关键的可能在代谢组实验。16S是基于测序技术，起步早，方法成熟，不同平台的检测能力、数据质量相对接近，在这里不做过多讨论。与16S 不同，代谢组学发展最晚，有一定特殊性，远比转录组、蛋白组更复杂，比如说鉴定、质量控制都存在很多难点。不同平台的分析能力差异还是非常大的。

● 从鉴定来说，代谢组无法像测序一样做拼接，也无法像蛋白组一样通过公共数据库直接解决鉴定问题。代谢物存在大量的同分异构体和分子质量相近的物质，因此如果通过分子质量去检索公共数据库往往会匹配到多个代谢物，这样的结果毫无意义。那代谢物究竟是怎么去做鉴定的呢？当仪器型号和参数固定了，代谢物碎裂形成的二级谱图也就固定了，但可避免的也会出现碎裂图谱相似的代谢物干扰匹配结果，所以一般还需要经验丰富的实验人员进行人工二次确认。正是因为代谢物有这样的特点，目前代谢物的精确鉴定是非常依赖于本地标品自建数据库+人工二次确认，也是决定不同分析平台鉴定结果可靠性的重要判断依据。

● 从质控来说，代谢个体化差异大，所以样本数量比其他组学要求多，因此实验稳定性是很关键的考察点，发文章也是需要展示质控结果的，同样的，在考量不同分析平台的时候质控也应该是非常重要的一项内容，不要忽视。 

如何进行16S+代谢组学的联合分析

关联分析是数据深入挖掘的一种方式，主要用来发现隐藏在数据集中的关联性或相关性。目前16S+代谢组学的联合分析分为三步：

第一步：分别对16S和代谢组的数据进行分析，筛选显著性差异菌群与显著性差异代谢物。

第二步：基于Spearman或Pearson统计学分析方法对显著性差异菌群与显著性差异代谢物进行相关性计算。相关性系数越大，表明对应的菌与代谢物之间的相关性越强。

第三步：借助网络图、层次聚类热图等可视化方法，从多个角度对相关性计算结果进行展示和挖掘，筛选引起代谢变化的关键菌株。

总 结

综上所述，16S+代谢的研究策略弥补了目前16S或宏基因对功能研究的缺失，是最具生物学意义的两个组学关联，打通了菌群多样性与功能，借助相关性分析，可以对关键菌株及其功能进行挖掘，能够把文章故事讲的更深、更完整、更创新。代谢组学发展较晚，是联合分析的关键，如果代谢组学数据质量存在问题是会影响联合分析数据挖掘。