扫描电子显微镜植物制作技术

　　随着扫描电镜在各学科领域的广泛应用,其涉及的样品种类日趋繁多,因此需要不断地探索新的制样方法。本文报道我们建立的几种生物样品扫描电镜特殊制样技术及获得的几张显微照片(图1～5)。

　　1 野生山楂品种资源分类鉴定扫描电镜制样技术

　　 本实验目的是利用扫描电镜对山楂种子表皮的纹饰进行分类。由于干燥后的中药山楂果实的种子外表面常附有一层果胶质和残留的果肉,给种子表面分析带来一定的因难,通常是采用酸解和超声波剥离法,但往往不易掌握而造成样品损伤。通过细胞学观察我们发现果肉与种子皮之间有一层果胶物质,利用果胶酶可以使这层果胶物质分解,从而清除种皮外表面的残余果肉和杂质,获得干净清晰的种皮纹饰照片。具体方法是:先将种子从果实中剥出,去掉大块的果肉。用5%的果胶酶(pH515)在25℃酶解30min至2h(视样品大小而定),用清水洗净凉干,将种子修成大小适宜的片段(视样品座尺寸而定)或不经修整。经乙醇系列脱水、醋酸异戊酯置换、二氧化碳临界点干燥、离子镀膜仪镀金,在扫描电镜下观察拍照。

　　2 植物花粉扫描电镜观察法

　　2.1 外表形态观察制样法

　　一般情况下,我们采用干燥剂脱水法,即将新鲜的花粉收集在培养皿内。置放于干燥器中过夜,经粘样镀金后直接用电镜观察。但对于壁薄的花粉样品(如禾本科植物)就会产生收缩、变形。为了解决这个问题我们采取固定—脱水—干燥法。即采集新鲜的花粉粒,封在滤纸做成的小囊中,立刻用2%戊二醛(011molΠL磷酸缓冲液配制pH712)固定2h,用缓冲液漂洗,1%锇酸固定lh,用缓冲液漂洗,经70%、85%、95%、100%、100%逐级丙酮脱水(每级15～20min),过渡到醋酸异戊酯,经二氧化碳临界点干燥,镀金后电镜观察,可见花粉粒形态饱满、结构清晰。

　　2.2 花粉粒剥壳内部结构观察制样法为了给花粉分类鉴定提供更多的分析依据,我们自行设计了一种用于研究花粉粒表皮厚度和花粉内壁结构的剥壳方法。其步骤为:采集新鲜花粉,用2%戊二醛固定l～3h,缓冲液漂洗2次每次15min,1%锇酸固定1h。漂洗后经丙酮系列脱水,临界点干燥后备用。取两个干净的扫描电镜样品铜座,在各样品座上表面涂一层树脂胶,待树脂半干硬时,往其中一个样品座上的树脂面撒一层经干燥的花粉粒；将另一个样品座树脂胶面向下,放在表面撒有花粉粒的样品座上。形成铜座—树脂胶—花粉粒—树脂胶—铜座的夹心结构,置于60℃保温2～4h,取出冷却后,将这两个粘连的铜座掰开分离,这样夹在中间的花粉粒也就被断裂成对应的两个部分,经镀金后,供扫描电镜观察、测量花粉壁厚度,甚至可看到断裂后的内含物形貌。

　　3 植物茎组织扫描电镜制样技术

　　植物茎断面组织形态的电镜观察,通常是用刀片直接截取茎段样品,经固定、脱水、干燥、镀金等步骤处理。但一些软茎组织在切割时,容易受切削力的作用而发生组织挤压变形。同时切割后的断面组织裸露在空气中因失水亦有不同程度的收缩,用这样的断面制成扫描电镜样品必然或多或少带有人为的假象。为此我们通过反复试验建立了一种适合于植物茎组织扫描电镜观察制样方法。主要步骤是切取大小约5mm×5mm,长3mm～4mm的茎组织块。用3%戊二醛固定2h,漂洗后,经35%、50%、60%、70%、95%、100%、100%各lh的乙醇系列脱水,过渡到纯二甲苯,在室温浸腊(溶点53℃)24h,移入40℃温箱逐步升温至56℃,加石腊至饱和,3h后将样品移入溶化的石腊中(换三次,每次2h)包埋成块,迅速冷却后固定在切片机的样品座上,用切片机对需观察的面进行修整,把修整好的样品转入二甲苯中脱腊(换三次,每次1h),从二甲苯过渡至无水乙醇,再过渡至醋酸异戊酯,经二氧化碳临界点干燥、镀金、电镜观察。结果显示,茎组织形态学结构完整层次丰富,立体感强而且真实。

　　4 红外干燥法

　　对于种子和某些材料质地致密的样品,可采用红外线干燥技术进行制样,如薏米、玉米、水稻等作物种子的淀粉粒结构扫描电镜观察分析。用此法可避免由于脱水不彻底而带来图像不稳定,分辨率低的问题。具体做法是将种子置500W红外线灯下距离20～30cm处,照射6h(亦可放在红外线水份测定仪中处理),取出种子,掰断后置于铜座上,镀金后供扫描电镜观察分析。

　　图1 花生花粉纹饰。图2 甘蔗叶脉表面结构。图3 花生花粉内壁结构。图4 甘蔗茎维管束。图5 薏米淀粉粒形态。

　　图1,图3,图5 Bar=10μm。图2 Bar=50μm。图4 Bar=100μm。