扫描电子显微镜生物样品制备技术详细介绍（十七）

低温制备方法

利用低温技术处理样品时，上述在室温制样过程中出现的许多问题都会大大减少。冷冻生物技术在生物样品的X射线分析研究中越来越重要，它大概是人们可望分析可溶性离子和元素的唯一途径。冷冻固定完全是个物理过程，能够显著地提高某些软生物组织的机械强度，水从液体转变为固体，抑制了生理过程，而且最大限度地减少可溶性物质的移动，因此，它大概是在接近自然状态下保存生物组织的唯一方法。此外，样品在低温下分析，还具有另一些优点：污染速率明显降低;样品在电子束下损伤较少。所以，这是一种较理想的方法，它与与冷冻超薄切片技术大致相同，主要区别是一个着重考虑结构，另一个着重考虑元素分析。下面就这些区别作简单讨论。

固定：对样品做任何形式的化学固定都能引起膜的渗透性发生显著变化，从而引起元素的重新分布，因此，最好不作任何化学固定。如果为了保持结构而必须固定时，最好是进行对照研究，一半样品经过固定，用于形态学研究，另一半不经固定，用于微区分析。

包埋:为了便于进行切片，需将样品放在溶于生理亲合液的惰性物质中包埋，当样品被冷却时，包埋剂又可增加样品的机械强度，有利于切片。通常包埋剂有：琼脂、牛血清蛋白、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和浓度为10%～30%的羟乙基淀粉(HES)等。

冷冻保护:在冷冻过程中，即使是极小的组织块，实际上或多或少总会产生冰晶损伤的，使用冷冻保护剂渗透样品，可大大减少冰晶损伤。研究表明：常用的穿透性冷冻保护剂如甘油和二甲基亚砜，虽然可以减小冰晶尺寸，能较好地保存结构，但却会给细胞带来严重的生理损伤，而且这些物质挥发性低，如果使用冷冻干燥技术，则难以将其去掉，因此，不适用于X射线分析。聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和羟乙基淀粉(HES)能明显地减少细胞中冰晶损伤，较好地保存结构，同时对组织的生理机能造成的干扰最小，而且它们又是较好的包埋剂，有利于切片，因此，是较好的冷冻保护剂。

冷冻方法:冷冻方法与冷冻技术一章讨论的基本相同，稍要注意的是：大部分生物材料进行X射线微区分析时，最好使用液氮，液态一氟二氯甲烷(84k)或含有8%甲基环乙烷的异戊烷(100k)冷却样品。如果进行含氯元素X射线分析，最好不要用碳氟化合物，否则微量卤族元素会留在冷冻样品中，影响分析结果。此外，组织冷冻一旦完成，应立即放入液氮中贮存或尽量保持低温以防止冰的再结晶。冷冻过程同样会引起可溶性元素的位移，但程度较轻。因为细胞内结冰的过程需要有一定的时间，这过程会有水的液相与固相共存的状态，此时，液体中电解质浓度显著增加，使膜的两侧附近的电化学梯度发生变化，因而反过来又造成某些离子的重新分布。