扫描电镜的样品制备方法

　　扫描电子显微镜样品制备比透射电镜样品制备简单，不需要包埋和切片。扫描电子显微镜样品的制备，必须满足以下要求：①保持完好的组织和细胞形态；③充分暴露要观察的部位；③良好的导电性和较高的二次电子产额；④保持充分干燥的状态。

　　某些含水量低且不易变形的生物材料，可以不经固定和干燥而在较低加速电压下直接观察，如动物毛发、昆虫、植物种子、花粉等，但图象质量差，而且观察和拍摄照片时须尽可能迅速。对大多数的生物材料，则应首先采用化学或物理方法固定、脱水和干燥，然后喷镀碳与金属以提高材料的导电性和二次电子产额。

　　化学方法制备样品

　　化学方法制备样品的程序通常是：清洗、化学固定、干燥、喷镀金属。

　　1、清洗：某些生物材料表面常附血液、细胞碎片、消化道内的食物残渣、细菌 、淋巴液及粘液等异物，掩盖着要观察的部位，因而，需要在固定之前用生理盐水或等渗缓冲液等把附着物清洗干净。亦可用5%碳酸钠冲洗或酶消化法去除这些异物。

　　2、固定：通常采用醛类(主要是戊二醛和多聚甲醛)与四氧化锇双固定，也可用四氧化锇单固定。四氧化锇固定不仅可良好地保存组织细胞结构，而且能增加材料的导电性和二次电子产额，提高扫描电子显微图象的质量。这对高分辨扫描电子显微术是极端重要的。为增强这种效果，可用四氧化锇-单宁酸或是四氧化锇-珠叉二胼等反复处理材料，使其结合更多的重金属锇，这就是导电染色。

　　3、干燥：固定后通常采用临界点干燥法。其原理是：适当选择温度和压力，使液体达到临界状态(液态和气相间界面消失)，从而避免在干燥过程中由水的表面张力所造成的样品变形。对含水生物材料直接进行临界点干燥时，水的临界温度和压力不能过高(37.4℃，218帕)。通常用乙醇或丙酮等使材料脱水，再用一种中间介质，如醋酸戊酯，置换脱水剂，然后在临界点干燥器中用液体或固体二氧化碳、氟利昂13以及一氧化二氮等置换剂置换中间介质，进行临界干燥。

　　4、喷镀金属：将干燥的样品用导电性好的粘合剂或其他粘合剂粘在金属样品台上，然后放在真空蒸发器中喷镀一层50～300埃厚的金属膜，以提高样品的导电性和二次电子产额，改善图象质量，并且防止样品受热和辐射损伤。如果采用离子溅射镀膜机喷镀金属，可获得均匀的细颗粒薄金属镀层，提高扫描电子图象的质量。

　　冷冻方法制备样品

　　低温扫描电子显微术是20世纪80年代迅速发展和广泛应用的方法。它包括生物样品的冷冻固定、冷冻干燥、冷冻割断和冷冻含水样品的扫描电子显微术等。

　　1、冷冻固定：将生物材料投入低温的致冷剂中，如液氦、液氮、液体氟利昂及丙烷等。快速冷冻可使生物组织细胞的结构和化学组成接近于生活状态。被冷冻固定的生物样品，可以在低温条件下转移到具有低温样品台的扫描电子显微镜 中直接观察无需进一步处理或仅在冷冻样品表面喷镀一薄层金属。这种方法不仅快速简便，而且可以排除由于干燥法造成收缩的假象，特别适合于研究含水量很高的生物材料。

　　2、冷冻干燥：生物样品经冷冻固定后，其中的水分冻结成冰，表面张力消失；再将冷冻样品放于真空中，使冰渐渐升华为水蒸气。这样获得的干燥样品在一定程度上避免了表面张力造成的形态改变。