本品在体内经酶转变为5－氟尿嘧啶脱氧核苷，与胸腺嘧啶核苷合成酶的活性中心形成共价结合，使该酶的活性受到抑制，使胸腺嘧啶核苷生成减少，导致DNA的生物合成受阻；此外，它还可转变为三磷酸氟尿嘧啶核苷，以伪代谢物形式掺入RNA中，从而干扰RNA的正常生理功能，影响蛋白质的生物合成。近年来研究发现，本品的活性代谢物5－氟尿嘧啶脱氧核苷及甲撑基四氢叶酸可与胸腺嘧啶核苷合成酶形成三联复合物，阻止胸腺嘧啶核苷合成酶的活性发挥，从而抑制DNA的合成。
本品对增殖细胞有明显杀灭作用，对S期细胞特别明显，但它同时又可延缓G1期细胞向S期移行，因而出现自限现象。
毒理研究
遗传毒性
本品在体外能诱导小鼠胚胎纤维细胞的癌性变，但致癌性与致突变之间的关系尚不明确。尽管本品对TA92、TA98和TA100鼠伤寒沙门氏菌未见致突变作用，但对TA1535、TA1537、TA1538鼠伤寒沙门氏菌和酿酒酵母菌又致突变作用。此外，本品小鼠骨髓微核试验结果阳性。在体外试验中，本品高浓度下可引起仓鼠成纤维细胞染色体断裂。
生殖毒性
大鼠腹腔注射本品125或250mg/kg可引起染色体畸变和精原细胞染色体结构的改变，也能抑制精原细胞的分化，从而导致不育。雌性大鼠在排卵前连续3周每周腹腔注射本品25或50mg/kg，能明显减少交配的发生，延缓胚胎植入前后的发育，增加植入前的死亡率，并导致胚胎染色体异常。
动物试验显示本品具有致畸作用。尽管尚无氟尿嘧啶引起人类畸形的直接证据，但应重视的是，其他DNA合成抑制剂已有导致人类畸形的报道。因此有生育可能的妇女应避免怀孕。如果患者在孕期使用本品或在用药期间怀孕，应被告知本品对胎儿的潜在危险。只有当本品的潜在益处大于对胚胎的潜在危险时，才可在孕期使用本品。
尚无本品围产期毒性研究资料，但本品可通过胎盘进入大鼠胎仔的血液循环，导致胚胎的吸收和死亡。尚不清楚本品是否经人乳排泄，鉴于本品可抑制DNA、RNA和蛋白质的合成，母亲在使用本品时应停止哺乳。
致癌性
尚无较充分评价本品致癌性的动物长期给药的试验资料。大鼠连续52周，每周5天连续经口给予本品0.3、1、3mg/只，随后观察6个月，未见致癌作用。雄性大鼠每周1次，连续52周静脉注射本品33mg/kg，随后观察其生命过程，也未见致癌作用。雌性小鼠每周一次，连续16周静脉注射本品1mg/只，对肺腺癌的发生率无影响。但根据现有资料尚不能对本品的人体致癌性作出评价。