抑制PTEN磷酸化可增强成胶质细胞瘤的放疗敏感性

　　PTEN (gene of phosphates and tensin homologue deleted on chromosome ten)是肿瘤抑制基因，其编码的具有磷酸酯酶活性的蛋白，是机体维持正常生理功能所必须的因子。作为肿瘤抑制基因，PTEN对受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase, RTK)/磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K )/蛋白激酶B(Akt)信号通路的调节起着关键作用。在体内，PTEN可通过拮抗酪氨酸激酶等磷酸化酶的活性，从而引发级联反应，影响细胞增殖、代谢，进而抑制肿瘤的发生发展【1】。

　　癌症和肿瘤基因图谱（Cancer Genome Atlas, TCGA）结果表明，PTEN与成胶质细胞瘤之间存在很高的相关性。在成胶质细胞瘤（glioblastoma multiforme, GBM）的治疗中，由于PTEN的缺失或突变而造成的AKT信号通路异常活化使得细胞对酪氨酸激酶抑制剂产生耐药性，影响治疗效果。在细胞质中PTEN往往作为脂质磷酸酶参与调节细胞增殖和存活发挥的作用，而在细胞核内，PTEN则在调控基因组稳定性、细胞周期进程，以及染色质重塑等方面扮演着重要的角色（下图）【1】。

　　成胶质细胞瘤是成人中发生率最高的颅内肿瘤，具有极高的侵袭性及神经破坏性。脑局部放射治疗（ionizing radiation，IR）是目前较为有效的治疗方法之一。IR消灭癌细胞的原理，主要是通过高剂量的辐射造成细胞内大量的DNA断裂，过度的DNA损伤累积超出了细胞自身的修复能力范围，从而导致癌细胞死亡。但是肿瘤细胞抗辐射性的存在使得放疗效果收效微弱，而其潜在的机制尚不明确【2】。

　　近几年研究表明，PTEN发生的翻译后修饰例如SUMO化，磷酸化，泛素化等等也会对PTEN的功能造成影响。2012年，加州大学圣地亚哥分校Frank B. Furnari组就在PNAS上报道了经过标准的药物治疗辅以放疗的成胶质细胞瘤病人样品中，普遍存在着PTEN 第240位酪氨酸的磷酸化修饰(pY240-PTEN)，并且这种修饰与病人较短的生存时间存在着密不可分的联系【3】。

　　那么pY240-PTEN是否会对细胞DNA损伤应答修复产生影响从而造成癌细胞对治疗产生耐受作用呢？

　　近日，Frank B. Furnari组延续先前的工作，在Cancer Cell上在线发表了题为Inhibition of Nuclear PTEN Tyrosine Phosphorylation Enhances Glioma Radiation Sensitivity through Attenuated DNA repair的研究论文，阐述了FGFR2可通过调节PTEN第240位酪氨酸磷酸化，促进pY240-PTEN与Ki-67在染色质上的结合从而招募重组酶RAD51促进成胶质细胞瘤细胞的DNA损伤修复，使癌细胞可以更好的应对放射治疗。

　　在本文中，研究人员首先分析了19例临床成胶质细胞瘤样本，发现pY240-PTEN含量较高的样本其DNA损伤修复进程与含量低的样本相比更快（以DNA损伤修复起始信号pH2AX作为指征），表明pY240-PTEN可能影响了DNA修复。基于此，研究人员体外构建野生型WT-PTEN和第240位酪氨酸点突变为苯丙氨酸而无法被磷酸化的Y240F-PTEN蛋白进行激酶反应，发现Y240-PTEN可直接被激酶FGFR2磷酸化。为进一步证明pY240-PTEN能够促进DNA修复，研究人员通过比较稳转了WT-PTEN和突变Y240F-PTEN的U87（PTEN null）成胶质细胞瘤细胞在IR处理后DNA双链断裂情况，发现WT-PTEN细胞DNA损伤程度较低。

　　DNA双链断裂对机体来说是最为致命的损伤。为了应对这种损伤，机体演化出了两种主要的双链断裂修复途径，一种是低保真的非同源末端连接修复（non-homologous end -joining, NHEJ），一种是高保真的同源重组修复(homologous recombination, HR)。通常，细胞主要选择HR对双链断裂进行修复，在这过程中重组酶RAD51能否正常被招募至损伤位点，是HR修复成功的关键之一。研究人员通过免疫荧光染色及报告系统试验发现在稳定表达Y240F-PTEN的细胞内存在着较WT-PTEN细胞更为有效的HR修复。

　　上述结果表明FGFR2通过磷酸化Y240-PTEN促进RAD51的招募从而增强DNA修复效率使细胞免于损伤带来的危害。另外，研究人员对来源于病人样本的成胶质细胞瘤干细胞的分析也表明了FGFR2调节的Y240-PTEN磷酸化对细胞在IR处理后存活至关重要。

　　紧接着，研究人员发现尽管PTEN在核质中均有分布，但主要是细胞核内分布的PTEN发生了Y240磷酸化。染色质结合蛋白分离实验发现WT-PTEN能够结合染色质并且IR处理能增强这种结合，同时也伴随着pY240和RAD51水平的上调。检测IR处理6h后H3K9me3（染色质凝集标志）水平发现在WT-PTEN细胞内其水平降低，亦说明PTEN结合染色质可以促进其松弛，以保证DNA修复蛋白能够进入损伤处。与此同时，研究人员在U87细胞中分别转入了磷酸酶功能缺失的G129R-PTEN和C124S-PTEN突变体，验证了pY240-PTEN在DNA修复中的作用依赖于自身的磷酸酶活性。

　　PTEN缺少DNA结合结构域，那么是什么因子在PTEN与染色质结合之间起到联系桥梁的作用呢？通过质谱分析以及体外验证实验，研究人员确定了Ki-67（细胞增殖标志蛋白）为PTEN结合染色质的联系蛋白，并且pY240-PTEN是通过结合Ki-67上的PP1-BD（protein phosphatase 1-binding domain）结构域从而被招募至染色质上发挥作用。

　　更进一步的研究表明，原位移植EGFRvIII/Y240F-PTEN星形胶质瘤细胞的Y240F knock-in小鼠较移植了EGFRvIII/WT-PTEN星形胶质瘤细胞的小鼠而言小鼠存活时间延长，成瘤能力下降。采用FGFR抑制剂对移植了成胶质细胞瘤细胞的小鼠进行处理，在这之后结合IR处理，肿瘤细胞生长明显受到了抑制。这些结果也为临床研究中利用FGFR抑制剂对GBM患者有针对性的结合放射治疗提供了有效的理论支持。

　　总而言之，上述工作阐明了成胶质细胞瘤中pY240-PTEN的存在是肿瘤细胞以产生DNA损伤为目的的治疗方式存在耐受性的原因。通过阻断Y240-PTEN的磷酸化或许能够提高肿瘤细胞对放射治疗的敏感性从而为疾病治疗带来新的福音。

　　原文链接：

　　https://www.cell.com/cancer-cell/pdfExtended/S1535-6108(19)30054-6

　　参考文献

　　1. Milella, M., Falcone, I., Conciatori, F., Cesta Incani, U., Del Curatolo, A., Inzerilli, N., Nuzzo, C.M., Vaccaro, V., Vari, S., Cognetti, F., and Ciuffreda, L. (2015). PTEN: multiple functions in human malignant tumors. Front. Oncol. 5, 24.

　　2. Bao, S., Wu, Q., McLendon, R.E., Hao, Y., Shi, Q., Hjelmeland, A.B., Dewhirst, M.W., Bigner, D.D., and Rich, J.N. (2006). Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature 444, 756–760.

　　3. Fenton, T.R., Nathanson, D., Ponte de Albuquerque, C., Kuga, D., Iwanami, A., Dang, J., Yang, H., Tanaka, K., Oba-Shinjo, S.M., Uno, M., et al. (2012). Resistance to EGF receptor inhibitors in glioblastoma mediated by phosphorylation of the PTEN tumor suppressor at tyrosine 240. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 109, 14164–14169.