抗体的纯化实验

实验方法原理 利用细菌胞壁蛋白的特性可以提供了一个快速、简捷、特异、高效的抗体纯化方法。这里细菌胞壁蛋白主要指蛋白 A 和蛋白 G，它们分别从金黄色化脓性葡萄球菌和 G 组链球菌分离纯化。它们能特异结合到免疫球蛋白的 Fe 部分。由于它们对不同的免疫球蛋白有不同的亲和力，所以应根据免疫球蛋白的种类和类型选择蛋白 A 或蛋白 G。例如，纯化免疫兔产生的多克隆抗体需选用蛋白 A 分离纯化，而免疫羊产生的多克隆抗体则用蛋白不同种类及类型的免疫球蛋白与二者亲和力不同。同理，具有蛋白 A 或蛋白 G 结合部位的嵌合蛋白也可用于抗体的分离纯化。蛋白 A 或蛋白 G 与抗体的结合可以通过酸碱度、盐浓度和温度的改变解离。蛋白 A 或蛋白 G 在实验室就能有效地偶联到介质上。

实验材料 抗体溶液

试剂、试剂盒 蛋白 A- 或 G-琼脂糖Tris-HCl NaCl

仪器、耗材 亲和柱

实验步骤

1. 建议从商业提供的蛋白 A- 或 G-琼脂糖开始。如从蛋白 A 或 G 偶联到介质开始，则偶联到溴化氰活化的琼脂糖的方法前面；

2. 蛋白 A- 或 G-琼脂在起始缓冲液（100 mmol/L，pH 7.5 Tris-HCl，100 mmol/L NaCl） 内室温放置 30 min。每 g 介质约用 10 ml 缓冲液。水合作用期间干介质体积将溶胀 3～4 倍，此后步骤如不注明均在室温下进行；

3. 溶胀后的介质在起始缓冲液内装柱。再用 5～10 倍体枳同样缓冲液洗柱，建议最大流速为 1 ml/min；

4. 3～5 倍体积 0.1 mol/L，pH 2.5 glycine-HCl 洗柱。洗去可能存在的污染物；

5. 再用 5～10 倍体积起始缓冲液平衡柱。若欲存放则应用含 0.02％ NaN3 的起始缓冲液平衡，然后 4℃ 保存；制备抗体溶液

6. 抗体样品液离心 10 000×g，10 min，除去沉淀；

7. 用等体积起始缓冲液稀释样品，或加入 1/10 体积 10× 起始缓冲液，以获得适当的 pH 和离子强度；

8. 上样，即将缓冲好的样品液加到亲和柱内。每 ml 溶胀介质可以上样 2 ml 多克隆抗体血清或 20 ml 单克隆抗体上清。通常上样的总 IgG 量应略低于柱总结合容量的 80％，每 ml 溶胀介质能结合 5～20 mg IgG；

9. 在洗脱前，用 10 倍体积起姶缓冲液洗柱。让 A280 值恢复到基线或本底水平；

10. 用 5～10 倍体积 0.1 mol/L glycine-HCl（pH 2.5） 缓冲液洗脱结合的抗体。洗脱液以 1 ml 为洗脱组分分部收集，收集试管含 0.1 ml 1 mol/L Tris-HCl （pH 8.0）缓冲液以便及时中和低 pH；

11. 汇集 A280 大于等于 0.2 的峰组分；

12. 若需除去盐分或改变缓冲液，可以在磷酸缓冲盐液（137 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KC1，6.5 mmol/L Na2HPO4）中透析，或过凝胶离心柱，或用超滤的方法；

13. 以 1 ml 为单位分装，近期用的存放 4℃， 长期储存放 -20℃；

14. 亲和柱用 5 倍体积 0.1 mol/L glycine-HCl（pH2.5）洗脱液再次洗后，用 10 倍体积起始缓冲液平衡，即可再次使用。如欲存放，用含 0.02％ NaN3 的起始缓冲液平衡后 4℃ 保存。

注意事项

与蛋白 A 或 G 结合的抗体最常用低 pH 溶液洗脱。应该注意在酸性条件下抗体不太稳定，较好的办法是用缓冲能力强的中性溶液收集洗脱组分。使目的抗体洗脱后很快进入中性环境，以免失活。