抗癌药物引起血液系统毒性作用观察

实验概要

掌握抗癌药物的主要毒性作用特点及作用靶点，学习外周血液细胞计数、骨髓涂片及观察方法。

实验原理

目前临床应用的多数抗癌药物是通过抑制肿瘤细胞的生长而产生活性，尤其是细胞毒类抗癌药物，这些抗癌药物对肿瘤组织和正常组织的选择性较差，在抑制肿瘤细胞生长的同时，将对正常组织产生很强的毒副作用。主要包括对造血系统细胞增殖的抑制作用；对胃肠道及其他消化系统的毒性作用；对免疫系统功能的抑制作用等。其中对细胞分裂及生长迅速的骨髓造血系统等具有极敏感的抑制作用，首先表现在骨髓血小板系统、粒细胞系统、淋巴系统等受到抑制，并最终红细胞的生成受到抑制。检查进入外周血循环各系细胞数量，反应对骨髓造血系统的毒性作用，作为适时检测用药的依据。

主要试剂

环磷酰胺，甲醇（固定细胞用）

主要设备

离心机，离心管，血细胞计数板，取血管，骨髓涂片用玻璃片, 吹风机。

实验材料

动物：昆明种小鼠

实验步骤

1.   给药：将小鼠随机分为A和B两组，每组10只，A组腹腔注射环磷酰胺60mg/kg,B组腹腔注射生理盐水0.5ml,连续3天。

2.   计数外周血细胞：取小鼠，尾静脉或眼内呲取血20 μl置于1980ul白细胞稀释液内(稀释100倍)，以玻璃棒或加样器取少许置血细胞计数板内，分别计数白细胞、红细胞和血小板数量，并与正常对照动物比较。

3.     骨髓悬液的制备、涂片、染色：处死动物，取股骨去净组织后，以1ml的注射器，抽取1-2ml血清或生理盐水，冲洗至离心管内。离心2000-3000rpm/m，3-5分钟，弃上清，将沉淀置玻璃片并涂片，快速干燥，甲醇固定，瑞士染色后，光学显微镜下观察并计数各系统细胞相对比例。

注意事项

1.   尾静脉或内吸取血量必须准确。

2.   骨髓涂片后要快速干燥，以防细胞形态皱缩。

[附录]

1.红细胞计数（red-cell counting）

1.1.材料

血红蛋白吸管、试管、血细胞计数盘及盖片、玻棒

1.2.红细胞稀释液配制

1.2.1.赫姆稀释液

氯化钠                            1g

硫酸钠(Na₂SO₄·10H₂O)               5g

 (或无水硫酸钠 Na₂SO₄               2.5g )

氯化高汞                          0.5g

蒸馏水加至                        200ml

过滤备用。

若血液中血浆球蛋白增高，使用该稀释液易发生红细胞凝集，可改用下列稀释液：

1.2.2.

氯化钠                          0.6g

枸橼酸钠                        1.0g

36％中性甲醛                    1.0ml

蒸馏水加至                      100ml

过滤备用。

1.3.方法

1.3.1.取样    在试管内加入红细胞稀释液1980ul，然后用吸管准确吸取20μl血液，擦净吸管外沾染的血液，将吸管插入试管底部，轻轻吹出血液，并用上清液吸洗吸管2～3次，将试管轻轻摇动1～2min，使血液与稀释液充分混匀。用洁净玻棒蘸取少量已混匀的红细胞悬液，一次滴入计数盘内，使之灌满，静置2～3min后计数。

1.3.2.计数  先在低倍镜下扫视计数盘内红细胞分布是否均匀，然后把计数盘中央的大方格置于视野中。并将镜头换成高倍，计数5个中方格（共80个小方格）内红细胞数。压在线上的红细胞，只计数一个中方格四条线中的两条线。最后把所得总数×10 000，即为1mm³（ml）血液中的红细胞总数。

2.白细胞计数（leukocyte counting）

2.1.材料

血红蛋白吸管、小试管（0.6×20px）、血细胞计数盘及盖片、玻棒

2.2.白细胞稀释液

冰醋酸                          2.0ml

1％龙胆紫                       1.0ml

蒸馏水加至                      100ml

 其中龙胆紫仅为显色用，以区别其他稀释液。

2.3.方法

2.3.1.取样    在试管内加入白细胞稀释液0.38ml，然后用吸管准确吸取20μl血液，擦净吸管外沾染的血液，将吸管插入试管底部，轻轻吹出血液，并用上清液吸洗吸管2～3次，将试管轻轻摇动1～2min，使血液与稀释液充分混匀。用洁净玻棒蘸取少量已混匀的红细胞悬液，一次滴入计数盘内，使之灌满，静置2～3min后计数。

2.3.2.计数  在低倍镜下计数内四角的四个大方格中所有白细胞数，最后把所得总数×50，即为每mm³（ml）血液中的白细胞总数。

3.血小板计数（platelet counting）

3.1.材料

血红蛋白吸管、小试管（0.6×20px）、血细胞计数盘及盖片、玻棒

3.2.血小板稀释液

3.2.1尿素稀释液

尿素                         10g

枸橼酸钠                     0.5g

40%甲醛                      0.1ml

蒸馏水加至                   100ml

 过滤后4℃保存备用。

3.2.2.草酸铵稀释液

草酸铵                       1.0g

蒸馏水加至                   100ml

过滤后4℃保存备用。

3.3.方法

3.3.1.取样    在试管内加入血小板稀释液0.38ml，然后用吸管准确吸取20μl血液，擦净吸管外沾染的血液，将吸管插入试管底部，轻轻吹出血液，并用上清液吸洗吸管2～3次，将试管轻轻摇动1～2min，使血液与稀释液充分混匀。静置3～5min，待红细胞溶解后再摇匀。用洁净玻棒蘸取少量已混匀的红细胞悬液，一次滴入计数盘内，将计数盘置于湿润的平皿内，15min后计数。

3.3.2.计数  计数方法同红细胞，总数×10000，即为每mm³（ml）血液中血小板总数。

细胞形态

红细胞：圆盘形，两面略凹，无核。

白细胞：圆形，有核。

血小板：椭圆、圆形或不规则形，大小约为红细胞的1/5~1/3，无核。

4.注意事项

4.1.所用器皿要干净。

4.2.血液与稀释液应充分混匀。

4.3.计数室内细胞分布要均匀。

4.4.细胞悬液滴入计数室内时，液量要适当，过多或过少都会影响计数结果。

4.5.血小板计数时，摇动试管要轻，以减少血小板破坏，推荐使用草酸铵稀释液。

骨髓涂片染色及方法

用瑞氏吉姆萨（Wright-Giemsa）混合染色法

1. Wright-Giemsa混合染色液配制

Wright染液                 5ml

Giemsa原液                 1ml

双蒸水                     6ml

2.染色步骤

涂片干燥后滴加Wright-Giemsa混合染色液，染5～10min后，自来水快速冲洗，晾干，镜检。