报道基因活性的同位素分析实验——CAT活性的相抽提分析法

转染细胞

氯霉素Tris·ClTMPD二甲苯

离心机离心管培养箱

一、来源于哺乳动物细胞

1.  按“CAT活性的层析分析法”中的步骤1~5的冻融法，制备哺乳动物细胞提取物。如果用胰蛋白酶消化或制细胞方法来收集细胞，则将原位裂解法的步骤1至4用以下的步骤2至4代替。

2.  室温下，300 g 离心5 min，弃去上清。每10⁷细胞加入1 ml 低渗缓冲液，离心，弃上清。然后每10⁷细胞加Triton裂解液200 μl。

二、来源于植物原生质体

1.  室温下，2 000~4 000 g 离心5 min，将植物原生质体细胞收集于1.5 ml 的微量离心管中，弃去上清。

2.  往细胞沉淀加50 μl 低渗缓冲液，在旋涡混合器上剧烈振荡，将离心管置于-70℃ 15 min以上，或置于干冰/乙醇浴中5 min 以冻结样品。融解样品，在室温下13 000  g 离心2 min，将上清移入一个干净管中。

3.  对于分析50 μl 细胞提取液，配置如下CAT分析混合液

20 μl  0.01 μCi/μl ［³H］氯霉素
5 μl  5 mg/ml 丁酰辅酶A
5 μl  2 mol/l Tris·Cl，pH8.0
20 μl  H₂O
 

4.  对每组分析，将50 μl CAT分析混合液加入50 μl 细胞提取液中。37℃温育30~90 min。

5.  用200 μl 2：1的TMPD/二甲苯剧烈报荡提取乙酰化的氯霉素，离心并移出上层液相至一只闪烁瓶中。

6.  样品中加3~5 ml 闪烁液，计数测定CAT的活性。