探针合成实验

基因

转录缓冲液 DTT RNA酶抑制剂 CTP ATP GTP S-UTP 乙酸铵 乙酸铵 乙醇

水浴锅 离心机 培养箱 烘箱

1.  在一个含SP6、T3或T7启动子的载体中，插入目的基因。在编码序列下游酶切使质粒呈线性。DNA以酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，70%乙醇洗后晾干。以无菌水重溶沉淀至1 μg/μl。

2.  室温配罝如下反应混合液（总体积20 μl）：
（1）4.0 μl 5×转录缓冲液

（2）0.2 μl 1 mol/l DTT

（3）60 U RNA酶抑制剂

（4）1.0 μl 三种10 mmol/l NTP中的每一种

（5）1.0 μl 1 μg/μl 酶切DNA

（6）10.0 μl ［³⁵S］UTP

（7）16 U SP6或T7 RNA聚合酶

（8）37℃温育30 min，再加16 U聚合酶并于37 ℃温育40 min。
 

3.  在反应混合液中加入：60 U RNA酶抑制剂，20 μl 10 mg/ml 的载体RNA和1.0 μl 酶1，于37℃温育10 min 以除去摸板。

4.  往反应混合液加入以下液体：0.8 μl 1 mol/l DTT、63 μl 无菌水和10 μl 3 mol/l 乙酸钠，取出1 μl 测定其 cpm/μl 值。

5.  加36.4 μl 7.5 mol/l的乙酸铵于反应混合液（终浓度2 mol/l）加50~100 μg tRNA载体和272 μl 冷无水乙醇，置干冰上沉淀10 min，以冷70%乙醇洗沉淀，晾干，需要的话可重复此步。以100 μl 10 mmol/l DTT重溶DNA沉淀。

6.  确定其 cpm/μl 值，并计算掺入百分比，核糖核酸探针应于2~3天内使用。 （70%到90%的标记掺入，结果可得70~90 ng 标记的RNA）。