探针有DNA探针和寡核苷酸探针。
探针标记方法有:随机引物标记、切口平移法、末端标记法。
切口平移是切口产生3'羟基和5'磷酸基团,DNA延伸合成3'端,5'端被小片段降解,缺口位点沿着双链向3'端移动,是在体外向DNA分子引入放射性标记核苷酸的技术。
随机引物合成是使寡核苷酸引物与DNA模板结合,在Klenow酶的作用下,合成DNA探针。
末端标记法通过末端脱氧核糖核苷酸转移酶催化标记的dNTP加到单链或双链DNA的3,末端上。
探针合成的注意事项
①合成探针的长短,一般在20~50个核苷酸之间。合成过长成本高,且易出现聚合酶合成错误,杂交时间长,合成太短则特异性下降。
②碱基组成G-C应含40%~60%,一种碱基连续重复不超过4个,以免非特异性杂交产生。
③探针自身序列内应无互补区域,以免产生“发夹”结构,影响杂交。
总之,一个好的探针最终要在实践中才能加以确认。
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