诊断支原体感染和诊断衣原体感染一样必需经过实验室检查，不能仅仅根据症状就作出诊断。目前诊断支原体感染用的是培养法和血清学检测法。
(1) 支原体培养
标本的取材男性为尿道内口约0.5cm以上，女性提倡子宫颈棉拭子取材，而不用尿培养。支原体的培养和鉴定是确诊支原体感染的唯一方法。每种培养基都用酚红作标记，人型支原体和脲原体可使培养基变成粉红色。
(2) 支原体血清学鉴定
1984年开始使用一种微量的酶标免疫法，能检测支原体的8种血清型抗体。这对于诊断患者为哪一种支原体血清型感染是很有帮助的。
