攻克多重PCR之难（下篇）

　　多重PCR能够在提高通量的同时节省样品降低成本，它需要耗费更多的时间和精力，同时也会给用户回报更丰富的数据。本文介绍了一些实验技巧和商业化工具，希望能帮您轻松获得好结果。

　　原则三、四、五：优化dNTP、MgCl2、聚合酶和盐的浓度

　　现在剩下的就是调整反应条件了。要一次进行这么多种反应，我们当然不想在反应中缺了哪个组分。一般多重PCR需要更多的dNTP、镁离子和聚合酶。 Nichols推荐使用0.3 mM dNTP(而非标准的0.2 mM)、2.5 mM Mg2+(而非1.2至2 mM)以及每50μL反应体系5 units聚合酶(而非1.25 units)。最后再试试盐浓度，“在优化的时候，增加盐总会有帮助，尤其能增加特异性。”

　　PCR master mix含有缓冲液、盐、dNTP、Mg和聚合酶，如果我们使用常规1.25× 或1.5×的PCR master mix就已经差不多做到了上述原则的三至五。另外，您还可以选用转为多重PCR优化的产品，例如NEB的多重PCR 5× Master Mix、Bio-Rad的iQ™ Multiplex Powermix、或者安捷伦的Brilliant Multiplex QPCR Master Mix。

　　据安捷伦的Mason介绍，Brilliant Multiplex QPCR Master Mix是经过专门设计的，能够很好的解决同一管中不同反应相互竞争的问题。如果一个目标片段出现1000次，而另一个目标片段只出现了10次，那么后一个片段就很容易沦为背景。“我们的多重PCR试剂盒能够在同一个管中准确定量低丰度和高风度的目标片段，克服偏向性，”Mason说。

　　我能扩多少目标片段

　　一般来说，最多能在同一个管中同时检测到五个目标片段，这既是出于引物设计的考虑，也是由多重定量PCR的硬件条件决定的。实时荧光PCR仪通常最多检测4 至5个颜色通道，其中一个可能还要留作参考通道。凝胶电泳虽然不受此限制，但多引物一同作用仍然存在困难，因此还是最多达到五重PCR。 “设计更多是极具挑战性的，”Cockrum说。

　　多重定量PCR的染料

　　能进行多重定量PCR的仪器包括：Life Tech公司的QuantStudio™ 12K Flex Real-Time PCR System、安捷伦公司的Mx30005P等等。据Cockrum介绍，Bio-Rad公司的CFX96 Touch™ Real-Time PCR Detection System具有五个通道，每个通道配有单独的激发光源和检测器。在典型配置中，通道1用于FAM，通道2用于HEX或VIC，通道3用于Texas Red或ROX，通道4用于Cy5，通道5用于Quasar 705。目前最流行的选择是HEX、FAM和VIC，而FAM/HEX和FAM/VIC是用的最普遍的。Life Tech除了生产VIC外，近期又发布了两个新染料ABY和JUN以及一个新passive reference dye――Mustang Purple。

　　Cockrum建议将染料强度与模板丰度结合起来，用最亮的染料(通常是FAM)配最少的模板，用最黯淡的染料(例如Cy5或Quasar 705)配丰度最高的模板(如看家基因)。

　　更多重的PCR

　　当然，引物设计是多重PCR的最大障碍，不过一旦克服了这一障碍我们就能进行更多重的PCR反应。安捷伦的MassCode技术就能够超越定量PCR仪带来的硬件限制，安捷伦公司将这一技术推荐给那些想要同时筛选十个以上目标片段的用户，例如可以用来检测病原体。

　　MassCode 技术融合了多重PCR和LC/MS技术。首先，开展多重PCR，每个引物都带有一个化学标签(tag)。随后纯化PCR产物，并上样到LC/MS系统中，切除标签用质谱仪进行检测。2011年，安捷伦公司的科学家就进行了14重反应，对多种沙门氏菌进行检测和分型。

　　引物设计软件

　　怎样设计能够相互兼容的引物呢?简而言之，用软件。现在市面上有很多免费的引物设计软件，例如IDT公司的RealTime PCR calculator。Nichols选择的是Primer3 (MIT, Cambridge, MA)，随后通过UCSC Genome Browser再次筛选潜在的引物序列，以避免脱靶。

　　此外，也有不少商业化工具可供选择，例如Premier Biosoft家的Beacon Designer(Bio-Rad公司有提供哦)。这个软件能够通过全基因组BLAST搜索来避免重复序列，通过结构预测来避免高度折叠区域，通过配对测试来剔除可能的引物二聚体。据该公司介绍，这一软件能够大大帮助多重PCR的引物设计，从上百万种潜在组合中挑选出少量符合标准的引物呈献给用户，以便用户进行实验验证。

　　多重PCR能够在提高通量的同时节省样品降低成本，它需要耗费更多的时间和精力，同时也会给用户回报更丰富的数据。如果您有兴趣进行多重PCR，那么希望本文中介绍的技巧和产品能够使您的实验更轻松，得到更好的结果。