放射免疫分析法原理及操作注意事项

放射免疫分析的原理：就是利用放射性核素标记抗原或抗体，然后与被测的抗体或抗原结合，形成抗原抗体复合物的原理来进行分析的。它又分为两种方法。

一、竞争性RIA，又称传统RIA

主要特点：标记的是抗原。其原理：未知抗原Ag+标记抗原Ag +已知定量抗体Ab标记抗原与抗体复合物AgAb+未知抗原与抗体复合物Ag Ab+游离标记抗原Ag （去除）（未知抗原多，标记抗原与定量抗体结合的复合物就少，表现为负相关）。

临床上甲胎蛋白（AFP），癌胚抗原（CEA），8 一微球蛋白（pz—MG ），铁蛋白（Fer），人绒毛膜促性腺激素p亚单位（HCG-13）等的检测都是竞争性RIA法原理。竞争性RIA法，根据加样顺序与温育次数的区别，反应方式分三种：平衡法，将非标记抗原（被测物与标准品）、抗体、标记抗原依次加入反应管，混匀后一次性温育至反应达到动态平衡，再加分离剂分离B（复合物）与F（游离物）如：AFP，8 一MG，Fer；顺序加样法，先将非标记抗原（被测物与标准品），与抗体在反应管内作第一次温育，待反应达到动态平衡后。加入标记抗原，再作第二次温育后，分离B与F如：CEA；急诊检测法：为临床急需检测结果而提出的反应方式，不等RIA 反应达到动态平衡就终止反应；分离剂的选择有，PEG（聚乙二醇），第二抗体等。

现在一般采用的是：第二抗体与PEG合用的方法，称为双抗体一PEG法。

PEG原理：PEG浓度达到7 一9 时能使抗原一抗体复合物沉淀。

优点：经济，简便，通用。

缺点：重复性差，非特异性结合率高。

第二抗体：第一抗体是可与被测抗原进行特异结合的抗体，来自家兔或豚鼠。用第一抗体为抗原，作用到羊，马身上，产生的抗第一抗体的抗体称第二抗体。第二抗体与第一抗体在适当条件下发生特异性结合，生成分子量很大的免疫复合物（AgAb ×Ab ），能自然沉淀。

优点：分离效果好。非特异性结合率低。

缺点：增加经费投入。需要第二次温育，延长了时间。

所以就产生了两者合用的双抗体一PEG法，它结合了上述两种方法的优点。

二、非竞争性RIA，又称免疫放射分析（IRMA）

主要特点：标记的是抗体。

按反应原理分为两种：

（一）单位点IRMA

其原理：抗原只有一个抗原决定簇，所测的抗原为小分子抗原，Ab+AgAg Ab+ Ab+ ImAd—Ag ImAd—AgAb+Ag Ab（去除）（负相关）：（ImAd—Ag）固相抗原免疫吸附剂，一般用聚苯乙烯塑料珠包被抗原；双位点IRMA：抗原有两个抗原决定簇，所使用的两种亚型抗体在与同一抗原分子结合时互不干扰ImAd—Ab+AgImAd—Ab—Ag+ AbImAd-Ab—Ag- Ab+ Ab（过剩的，游离的）：（ImAd—Ab）固相抗体免疫吸附剂，一般用聚苯乙烯塑料珠包被抗体。
（二）双位点IRMA，又称双抗体夹心法

从加样测定顺序上看，有三种方法：固相抗体先与未知抗原结合，再与标记抗体结合（正向两步法）。然后去除游离的标记抗体，测固相抗体一抗原一标记抗体复合物的放射性计数；未知抗原先与标记抗体结合，再与同相抗体结合（反向两步法）。然后去除游离的标记抗体，测固相抗体一抗原一标记抗体复合物的放射性计数；未知抗原与固相抗体和标记抗体同时反应（一步法，又称同时加样法）。然后去除游离的标记抗体，测固相抗体一抗原一标记抗体复合物的放射性计数。
这三种方法都生成夹心状的抗体一抗原一抗体复合物，故又称双抗体夹心法。

糖类抗原CA50，CA125就用的是其中的第三种方法（一步法），血清中的未知抗原与固相抗体和标记抗体同时反应，生成夹心状的抗体一抗原一抗体复合物，然后去除游离的标记抗体，测固相抗体一抗原一标记抗体复合物的放射性计数。

三、RIA法的影响因素

pH和离子强度；反应温度，温度一般为37℃，也有45℃，室温，4℃ 冰箱；反应时间，操作中的注意事项：戴手套、防护镜等，将试剂盒从冰箱中取出，室温下放置30 min方可使用。

（1）编号：第一排是标准管：根据标准品浓度由低到高A，B，C，D，E，F，G……；第二排是被测样品1，2，3，4，5，6，……。

（2）加样要准确，移液器的使用（两个档位，一档吸人，二档排出）吸头（一个标本一个吸头，避免互相污染）。加试剂：先看瓶签，再摇匀，最后吸人。（标记物一般为红色，一抗为兰色）。

（3）温育时间要保证：按说明书中所要求的时间温育，可以延长，不能缩短。

（4）分离剂加入：混匀静置时间，可以延长，不能缩短。保证抗原抗体复合物与第二抗体的充分结合。

（5）温度：注意观察水浴箱的水温，误差不能太大，为±1℃ ，室温21℃左右。

（6）离心时间：也应按说明书中所要求来操作，转速一般为3 500r/min。往离心机里放反应管时，尽量让它直立（因为倾斜可能会使液体流出）。吸上清液时，沉淀物在试管底部，真空泵的吸头头部不能直接插人到试管底部中央（会吸走沉淀物，而我们的目的是分离保留沉淀物），应该使吸头贴着试管管壁往下放，并且试管要稍微倾斜，但要在即将插到沉淀物边缘时停止，快速上升取出。少留一点点上清液也可。主要是保证沉淀物完整。

（7）进人免疫计数器测量时，注意观察做出的曲线好坏：是不是需要修改，剔除坏点。

（8）报结果：碰到异常结果，要再次看一看沉淀物是否都在，患者情况如何，结果是否与患者情况相符，方可报出。非竞争性RIA法中，清洗固相包被珠时，清洗次数要严格按说明书中所要求来操作，不得减少。虽然RIA法的影响因素很多，但操作中只要注意上述事项，RIA法的稳定性还是相当不错的。主要是它存在放射污染，这个问题不易解决，影响了它以后的发展，如今电化学发光免疫分析，化学发光免疫分析，酶联免疫分析，磁酶免疫分析等相继推出，发展很快。 RIA法将被淘汰。

参考文献：

（1）程绍钧，余裕民.检验核医学[M]。重庆：重庆大学出版社，2003，62—75