教你如何玩转tRNA机制研究（一）

文章导读：

“忽如一夜春风来，千树万树梨花开！”自然界的花花草草在悄无声息的感受着大自然的变化。随着全球气候的变化，环境温度也在不断的变化，那么什么是温度感受器？AET1是tRNA上鸟苷转移酶，它是水稻高温条件下正常生长所必需的。本文研究结果表明，tRNAHis鸟苷转移酶AET1在植物应对高温环境中发挥着重要作用。

发表期刊：MOLECULAR PLANT

影响因子：10.12

实验方法：tRNA测序、RIP、RIP qPCR、RNA pull down

文章内容：

1. AET1突变水稻热敏性
   

AET1突变水稻在高温环境下生长时主要呈矮小株，叶片狭窄卷曲，无法产生种子，相反在相对温和环境下生长时没有展现其他异常性状。AET1基因的ORF区第1144个SNP（C突变为T）会引起第382个氨基酸从脯氨酸改变为丝氨酸。预测AET1基因编码tRNA鸟苷转移酶，多物种比对结果显示AET1基因在包含哺乳动物在内的多种真核生物当中都是高度保守的，而第382个氨基酸在大部分双子叶和单子叶植物中也是高度保守的。遗传互补分析（genetic complementation test）显示互补品系以及过表达水稻株都能够有效的逆转高温下AET1突变所造成的异常形状。CRISPR/Cas9的基因编辑水稻株也可以造成明显的生长缺陷。控制变量实验表明温度是造成这一现象的环境因素，并且AET1基因是水稻对非生物因素敏感的主要原因。进一步观察可以看到的是，尽管野生型和AET1突变水稻幼苗们没有明显的形态学改变，但是超微结构已经有巨大的改变，表明AET1基因对于高温条件下细胞的增值是必不可少的。所有的形态学观察和表型实验都说明AET1在水稻的生长、发育过程中对高温的应答过程种起到重要作用。

图1. AET1突变体是热敏性的

2.AET1对tRNAHis成熟和tRNA表达稳态起重要作用

体外酶活实验证明AET1编码的AET1His可以结合到pre-tRNA（tRNAHis前体）并在pre-tRNAHis 5’端添加鸟嘌呤，然而发生了突变的AET1P382S没有该功能，表明被突变的382位的脯氨酸对于tRNA的鸟嘌呤转移酶活性是必不可少的。tRNA测序（云序生物提供）结果表明，野生型和AET1突变型水稻株在正常和高温条件下成熟tRNA的表达水平改变。测序结果表明，正常温度下AET1突变体和野生型当中的tRNA异形体（isotype）含量相差不大，但是在高温条件下AET1突变体当中的含量要明显的高于野生型水稻株，并且高温条件下头部5’带有鸟嘌呤的tRNA在AET1突变体当中有明显的下降，这些现象都说明常温下，AET1基因的酶活性在AET1突变体当中没有太大改变，但高温下酶功能会明显丧失。tRNA测序分析可以看到其他类型的tRNA，比如tRNAMet，在AET1突变株当中的tRNAMet有明显减少，由于tRNAMet和蛋白的翻译效率相关，所以推测在高温条件下AET1敲除水稻株的发育缺陷很有可能是因为蛋白翻译效率低下造成。AET1基因对于tRNA丰度的维持必不可少，AET1的突变足以改变tRNA表达谱，在高温环境下，AET1介导的tRNA修饰可以改变多个和蛋白翻译效率相关的tRNA的表达水平。

图2. AET1突变在体外消除了AET1的活性，并破坏了体内tRNA表达谱

3.AET1、RACK1A、eIF3h在内质网上的相互作用

酵母双杂交实验说明两个和核糖体相关的蛋白RACK1A以及eIF3h都和AET1相互作用。RNA pull down（云序生物可提供）也证明了AET1与RACK1A以及eIF3h结合。通过GST标签的RACK1A蛋白也能够富集MBP融合eIF3H。这些结果都能够进一步证明AET1、RACK1A以及eIF3h三个蛋白能相互结合。生物分子荧光互补实验证明RACK1A、eIF3h以及AET1三者能持续相互作用，这些结果都证明三个蛋白在体内能直接相互作用。融合蛋白的荧光信号显示，蛋白的荧光信号和ER（内质网）标志蛋白重叠，暗示三者之间的相互作用发生在内置网上与核糖体相关。GUS染色，qRT-PCR分析AET1，RACK1A以及eIF3h三个基因的mRNA表达量，三个基因在所有的组织当中具有广泛表达，证明三个蛋白相互作用和广泛的蛋白合成相关。

图3. AET1与ER中RACK1A和eIF3h相互作用