数字PCR的前生今世

　　近年来，数字PCR已取得了很大的进展，这在很大程度上要归因于商业化系统的开发，如QX200。这些技术进步似乎预示着一个转折点，更多的研究人员很快将能使用这种技术。这将推动新应用的开发，挖掘出数字PCR的全部潜能，并让科学家转向更强大的生物标志物研究，甚至单细胞分析。

　　2月底，Bio-Rad公布了第四季度的财报，收入同比增长5%。该公司表示，QX200 微滴式数字PCR系统的销售是这一增长的主要推动力之一。Bio-Rad的首席财务官兼执行副总裁Christine Tsingos指出，微滴式数字PCR产品的销售强劲，目前已有500多台投入使用。

　　近年来，数字PCR已取得了很大的进展，这在很大程度上要归因于商业化系统的开发，如QX200。这些技术进步似乎预示着一个转折点，更多的研究人员很快将能使用这种技术。这将推动新应用的开发，挖掘出数字PCR的全部潜能，并让科学家转向更强大的生物标志物研究，甚至单细胞分析。

　　漫长的开发过程

　　数字PCR与传统PCR的区别在于分析的终点 – 数字PCR通过计数来直接定量样品中PCR目标的数量，而不是像传统PCR那样，扩增那些目标，也不是像实时定量PCR那样，对目标丰度进行半定量的测定。

　　早期的数字PCR尝试曾在1992年的《Biotechniques》杂志中介绍过。作者利用样品的有限稀释，让每个孔中只获得单个模板分子。通过计算PCR后的扩增信号，研究人员可以更准确地确定起始分子的数量。这项技术的关键是分离模板，让每个孔中只有一或零个模板。这篇文章的作者是澳大利亚弗林德斯大学血液病学系的Alec Morley教授。他在开发数字PCR中的酸甜苦辣请看：白血病检测的故事。

　　在这之后，研究人员对数字PCR的兴趣日益浓厚，因为他们认识到了定量的潜力。1999年，Kinzler和Vogelstein在《PNAS》杂志上发表文章，首次使用了“数字PCR”的术语。这篇文章也是首次将数字PCR应用于临床样品，以寻找大肠癌患者中ras癌基因的突变。五年后，Vogelstein和Kinzler以及其他同事，报告了一种称为BEAMing的技术，它采用磁珠、乳液、扩增和磁性元件来实现另一种定量方法，对复杂生物样品中的特定目标序列进行分析。BEAMing后来被应用于新一代测序技术的开发，但它的出现也强调了需要一种新方法来分离单个分子。

　　尽管数字PCR的进步仍在科研实验室中继续，但商业化是一个非常缓慢的过程，数字PCR平台直到2006年才出现。这个时间上的滞后引出了一个问题：数字PCR既然如此有潜力，为何花了这么长的时间才开始流行？这一挑战可追溯到1992年的第一篇文章以及2003年的BEAMing文章，如何才能可靠地从复杂样品中分离单个分子。

　　分液遇上大难题

　　有限稀释是一种明智的分液做法，在小规模时相当有效，但在手动操作时容易出错。第一个相应的解决方案是以小的通道和微型管道的形式出现的。

　　微流体和lab-on-a-chip设计最早出现在2000年左右，但几年后才应用于分液。Fluidigm，由斯坦福大学的Stephen Quake创立的一家公司，最早开发出一种基于微流体的平台，能对DNA模板进行分液，用于扩增并提供数字读数。如今，这家公司拥有数字PCR芯片和实时定量PCR流体芯片，以近37,000个反应室处理最多48个样品。

　　在微流体平台之后，又出现了一种新的分液方法。它以大量的小液滴来取代各种通道。

　　微滴式数字PCR就利用单个的乳液微滴，每个都作为它们自己的反应仓，就好像微孔板上的单个孔。这些微滴式系统的扩展性允许创建数万个、甚至数十万个微滴，用于反应分析。RainDance Technologies和Bio-Rad的仪器都采用这一原理。

　　更多的微滴和通道

　　对于模板定量，数字PCR并非唯一的选择。实时定量PCR也能对样品中的目标模板进行相对定量。然而，就定量而言，这两种方法究竟孰优孰劣呢？

　　2013年，Fred Hutchinson癌症研究中心的研究人员比较了微滴式数字PCR和实时定量PCR的绝对定量，并将其结果发表在《Nature Methods》杂志上。研究人员发现，在定量microRNA时，微滴式数字PCR有着更高的精确度和相当的灵敏度。更让人惊讶的是，与实时定量PCR相比，数字PCR的重复性高了7倍。可靠的重复性意味着一段时间内开展的研究可直接比较 – 这对使用实时定量PCR的实验室而言是个挑战。

　　所有这些发现表明，在谈到临床诊断应用和生物标志物分析时，数字PCR可能是一个不错的选择。考虑到这种技术的灵敏度，它甚至为循环DNA或miRNA作为生物标志物打开了大门。

　　尽管仍处于应用的早期阶段，但数字PCR和微滴式数字PCR均显示出强大的接受度。从2013年到现在已有超过40篇文章发表，介绍微滴式数字PCR的应用或开发。它的应用也相当广泛，从生物标志物的分析到水性病毒的检测。显然，在未来几年中，数字PCR将要向我们展示20年前首次描述的那些潜力。