数字PCR技术更准确检测新冠病毒

　　对于新型冠状病毒（SARS-CoV-2）的检测，实时定量PCR一直是金标准。不过对于某些患者，qPCR的结果似乎每天都在变化，而且有不少假阴性。近期的研究表明，ddPCR检测能够减少假阴性结果，而Bio-Rad Laboratories公司也利用其微滴式数字PCR系统开发出新型冠状病毒的检测产品。

　　对于新型冠状病毒（SARS-CoV-2）的检测，实时定量PCR（qPCR）一直是金标准。不过对于某些患者，qPCR的结果似乎每天都在变化，而且有不少假阴性。近期的研究表明，ddPCR检测能够减少假阴性结果，而Bio-Rad Laboratories公司也利用其微滴式数字PCR系统开发出新型冠状病毒的检测产品。

　　数字PCR（ddPCR）不像传统的RT-qPCR那样需要根据标准品进行校准。而且，PCR反应被分割成数万个小液滴，在这种情况下，PCR抑制剂对样品的影响较小，检测灵敏度提高。在病毒载量低的情况下，例如SARS-CoV-2病毒感染的早期或无症状感染，这种检测尤为重要。

　　Bio-Rad数字生物学中心的生命科学营销主管Carolyn Reifsnyder表示，ddPCR对包含抑制剂的复杂样品具有特殊优势。“我们的检测是终点PCR，因此不存在qPCR所具有的抑制问题，”她解释说。“数字PCR让您更有信心，不会出现假阴性。”

　　我国的研究人员本月在medRxiv上发表了两项小型研究，表明数字PCR具有更高的灵敏度，并且能够检测出金标准RT-qPCR所错过的感染。

　　第一项研究是在武汉疫情暴发期间对ddPCR检测的评估。这项研究是由中国计量科学院、武汉和北京的疾控中心以及重庆大学联合开展的。研究人员利用Bio-Rad的QX200系统，对103名疑似患者、75名密切接触者和16名康复期患者进行检测，并将结果与三种不同的RT-qPCR试剂盒进行比较。他们发现ddPCR的检测限是两个拷贝，总体准确度约为96%。

　　对于疑似感染SARS-CoV-2的发烧患者，使用ddPCR的检测率从28%提高到87%。对于密切接触者，阳性率从21%降低至1%。研究人员还发现，年长的康复期患者在较长时间内具有较高的病毒载量。他们认为，ddPCR的灵敏度提高，特别适合判断这些患者是否应解除隔离。

　　第二项研究是由武汉大学的研究人员开展的。他们采集了57名患者的咽拭子，并比较了ddPCR和RT-qPCR的结果。研究人员在两种检测方案中使用了相同的引物和探针，发现ddPCR的检测限比RT-qPCR低500倍以上，总体准确度大约为94%。而且，在14名康复期患者中，9名患者的RT-qPCR检测结果为阴性，但实际上通过ddPCR可以检测到病毒。

　　文章的资深作者、武汉大学病毒学国家重点实验室的陈宇教授指出，咽拭子的病毒载量较低，而且由于大量的假阴性报告不可避免，导致未能及时诊断，尽早治疗或中断传播链。

　　他指出，尽管小规模使用时ddPCR的成本略高于RT-PCR，但如果大规模使用，则成本几乎相同。此外，考虑到ddPCR检测的准确性更高，因此可能不需要像RT-PCR那样对患者进行重复检测，在这种情况下，ddPCR实际上比RT-PCR更便宜。

　　“我们建议将ddPCR作为标准RT-PCR的补充。RT-PCR阴性的结果可利用ddPCR再次检测，因为RT-PCR的阳性结果是可靠的，”陈宇指出。他认为，目前应对COVID-19危机时，所有诊断SARS-CoV-2的方法（包括RT-PCR、ddPCR、IgM/IgG抗体检测和CT扫描）都有所帮助，应根据实际情况选择使用。

　　Bio-Rad的检测策略

　　根据Reifsnyder的说法，Bio-Rad一直在开发基于探针的三重检测，也就是检测SARS-CoV-2 N基因上的两个靶点，以及Rpp30基因，后者是人RNase P基因的标志物，可作为阳性对照。该检测使用鼻咽拭子和多孔板，因此可以同时运行96名患者的样品。“不需要qPCR那样的标准曲线，因此您不会浪费任何孔，”她说。检测时间大约为五个半小时。

　　Bio-Rad与Biodesix合作开发了ddPCR检测，并申请美国FDA的紧急使用授权，以便用于CLIA实验室的检测服务。此外，他们自己也在开展研究，争取成为EUA的检测制造商。同时，Bio-Rad还在与全球其他监管机构积极展开对话。

　　这款ddPCR检测可在QX200系统以及QXDx系统上运行，QXDx系统在去年2月获得了美国FDA的许可。Reifsnyder解释说：“QX200和QXDx基本上是同一台仪器。QXDx根据美国的临床应用进行了调整，而QX200通过了CE-IVD认证。不过，随着全球监管要求的放松，在疫情期间许多实验室也能够在RUO仪器上检测SARS-CoV-2。”

　　除了临床检测，Bio-Rad还提供了多个产品来支持COVID-19的研究和诊断开发。例如，他们提供了一步法RT-qPCR预混液，该预混液经过优化，可直接从RNA中扩增靶点，此外还有SARS-CoV-2标准品以及阴性标准品。这些材料是由去年被Bio-Rad收购的Exact Diagnostics公司开发的。当然，还有CFX实时定量PCR检测系统，包括CFX96 Dx、CFX96 Touch和CFX384 Touch。

　　Reifsnyder表示：“如今，我们正在全天候工作，向包括公司和政府实验室在内的世界各地的实验室提供qPCR产品。” Bio-Rad并没有透露具体的仪器安装数量，但表示到目前为止已经放置了数千台QX200仪器，而且QXDx的数量也在激增。“我们的制造工厂仍在运转中……我们的QX200和CFX生产线仍在满负荷运转，全天候生产尽可能多的仪器。”