敲降斑马鱼基因的方法学比较

一、基因敲降的前期准备工作相同
1.1 生物信息学分析目标基因在斑马鱼早期胚胎发送过程中是否有表达。
1.2 收集斑马鱼早期发育胚胎（通常为48 hpf前的胚胎），提取总RNA，然后进行体外转录（RT）。
1.3 设计检测目标基因表达的PCR引物，以1.2获得的cDNA为模板，进行PCR扩增，确认目标基因在早期有表达。
 
二、MO法与CRISPRi法的敲降原理不同
2.1 MO是在转录后水平上敲降基因的功能（MO-Spl阻遏原始转录本的剪接，MO-Atg阻遏成熟转录本的翻译）（基因转录后调控）
2.2 CRISPRi 是在转录水平上敲降基因的功能（抑制基因的转录）(基因转录水平的调控）。
 

• 敲降工具有效性验证的方法不同

3.1 吗啡啉敲降法（确认有效性）的技术路线
抑制翻译的MO（MO-Atg）和抑制剪接的MO（MO-Spl）二者敲降基因的有效性评价方法不同。抑制剪接的MO（MO-Spl）的有效性评价方法是通过RT-PCR直接检测原始mRNA转录本的正常剪接是否被改变；抑制翻译的MO（MO-Atg）的有效性评价通常需要通过蛋白质印迹法进行检测。但是，由于适用于斑马鱼的抗体很少，过去一般通过报告基因法来进行有效性评价（参见我们发表的论文Dong et al., 2017. J Biol Chem. 292(31):13045-13055 )，但后来斑马鱼领域给出的MO使用指南（见已发表的研究论文：Stainier et al., 2017. Plos Genetics, 13(10): e1007000）指出这种报告基因评价法缺乏特异性，因而不再推荐该报告基因评价方法。也正是由于没有相应比较方便的评价方法，一般不推荐此种抑制翻译（MO-Atg）的MO敲降法。确认抑制剪接的MO（MO-Spl）敲降基因有效性的技术路线如下：
3.1.1 分析斑马鱼目标基因的基因组组成（外显子-内含子结构），然后针对该基因，设计阻遏原始转录本剪接的吗啡啉（morpholino）（MO-Spl）。
注：MO-spl不能阻止母源转录本的翻译，如果要阻止母源转录本的翻译，需要设计阻遏原始转录本翻译的吗啡啉（MO-Atg）。
3.1.2 订购吗啡啉MO-Spl或MO-Atg和标准对照MO。
3.1.3 将不同浓度的MO-Spl注射入斑马鱼受精卵（标准对照MO仅注射最高浓度）
3.1.4 待注射胚胎发育至特定时期（优选48 hpf前的某些时期），收集胚胎，提取总RNA，然后进行体外转录（RT）。
3.1.5 按1.3已建立的方法进行RT-PCR扩增，确认目标基因的原始转录本的正常剪接是否被阻遏（发生异常剪接）。同时，设置检测管家基因表达作为内参对照，确认整个RT-PCR过程正常。
注：如果是使用MO-Atg，则无简单易行的有效性检测方法（一般不做有效性检测，仅开展特异性检测）。
3.1.6 分析3.1.5的实验结果，确定MO敲降工具的有效性，以及实现有效敲降的最低注射浓度。
 
3.2 CRISPRi敲降法（确认有效性）的技术路线
CRISPRi敲降的有效性可以通过RT-PCR法检测目标基因表达水平是否被有效下调来进行直接评价。一般使用普通半定量RT-PCR即可，确有需要，可以考虑定量RT-PCR法确认敲降程度。
3.2.1 分析目标基因的基因组结构，确定目标基因转录起始位点和/或5’UTR位置。 根据目标基因的转录起始位点的特征，设计sgRNA识别位点---CRISRP序列的设计（不少于4个）。
3.2.2 体外合成至少4条不同的sgRNA（每基因）和 dCas9-Eve mRNA。
3.2.3 将4条sgRNA按不同浓度和dCas9-Eve mRNA混合后共同注射斑马鱼受精卵。同时以相同浓度的dCas9-Eve mRNA注射受精卵作为空白对照。
3.2.4 待注射胚胎发育至特定时期（优选48 hpf前的某些时期），收集胚胎，提取总RNA，然后进行体外转录（RT）。
3.2.5 按1.3已建立的方法进行PCR扩增，确认目标基因的表达水平是否被有效抑制（阻遏转录）。同时，设置检测管家基因表达作为内参对照，确认整个RT-PCR过程正常。
3.1.6 分析3.2.5的实验结果，确定CRISPRi敲降工具的有效性，以及实现有效敲降的最低注射浓度。
 
四、CRISPRi敲降方法的特异性优于MO法的特异性
基因敲降方法的特异性需要通过表型拯救的方法来回答。之所以需要表型拯救，是因为需要排除基因敲降的表型是由于敲降工具的脱靶或者敲降试剂本身的毒性而导致的非特异表型，换句话说，要排除敲降表型是源于基因敲降工具的脱靶或者试剂本身的毒性所造成的这种可能。
拯救的基本实验策略是：在基因敲降的基础上，过表达被敲降的基因（通常是同时显微注射目标基因的戴帽mRNA），然后观测原来出现的表型是否被恢复（或有所恢复）至正常（参见我们发表的论文Dong et al., 2017. J Biol Chem. 292(31):13045-13055 )。如果基因敲降的表型在过表达目标基因的mRNA后有很好的拯救，那么可以确认敲降方法是特异的。
基于基因组编辑技术的CRISPRi敲降方法，一般同时注射4个sgRNA + dCas9-Eve mRNA。先前的很多研究已经发现，单个sgRNA引导dCas9-Eve所发挥的抑制基因表达的功能远没有多个sgRNA同时引导dCas9-Eve发挥的抑制功能强（参见我们发表的论文Dong et al., 2017. J Biol Chem. 292(31):13045-13055 )，这种多个sgRNA的协同作用决定了CRISPRi法脱靶作用可以忽略，而RNA本身的毒副作用是完全可以进行对照的（使用一组仅注射dCas9-Eve mRNA作为对照）。
相对而言，MO的脱靶效应要大很多。事实上，有实验证据表明：即使有多达5 bp的错配，MO也会发生作用。而对于一个25 nt长的MO而言，5 bp错配在基因组中的类似序列可以是成白上千。因此，MO敲降的脱靶机会很大。
另外，有研究报道注射MO可异常激活斑马鱼p53基因的表达，非特异性地诱导胚胎细胞凋亡，因此，在很多情况下，如果使用MO作基因敲降，是需要同时注射敲降p53基因的MO以抑制过表达的p53（请参考已发表的文献Robu et al., 2007. PLoS Genet. 3(5):e78）。
窗体底端
窗体底端
再者，如果MO自身就存在毒性（源于序列本身或者化学合成过程），则是无法进行对照的。MO方法刚发明不久，就有研究指出即使是同一种序列，不同批次合成的产品的毒性也可能是不一样的，显然，这种“内在”的毒性是无法进行对照的。
 
五、CRISPRi敲降工具（RNA形式）供货周期远短于MO敲降工具
由于MO工具需要在美国合成，受进口手续、海关通关等的影响，到货时间一般不少于30个工作日。而CRISPRi敲降工具（RNA形式）完全有本公司自主生产（已申请国家发明ZL，ZL申请号：201610843834.8），不超过20个工作日（一般为10个工作日）即可制作好，干冰寄送（到货）。
 
六、CRISPRi敲降工具（RNA形式）的费用低于MO法的敲降工具（人民币元）

 
七、优先推荐CRISPRi法敲降斑马鱼基因
一般来说，一个基因的敲降方法如果尚未见报道的话，仅以一个MO敲降的话，未来发表论文时，审稿人一般会要求需要再有一个独立敲降的方法重复前一个MO的实验结果。其原因也非常简单，因为基因是否被成功敲降是研究基因缺失功能的前提。只有确认基因本身被成功特异敲降，才能开始后续的功能研究（表型分析）。在不确定敲降方法是否有效且特异的情况下，所有获得的结果毫无疑问都是值得存疑的。
因此，我们推荐使用CRISPRi + MO 法同时进行敲降同一个基因（参见我们发表的论文Dong et al., 2017. J Biol Chem. 292(31):13045-13055）。在使用两种独立的、原理完全不同的敲降方法后，如果得到的敲降效果（表型）是一样的，那么这样建立的基因敲降方法毫无疑问可以被认可是有效且特异的。
如果一定只想先选用一种基因敲降方法筛选初步评价基因缺失功能，我们优先推荐CRISPRi法，理由如前述（有效性高、脱靶机会小、毒副作用小、供货周期短、价格便宜）。