整装培养细胞生物膜系统的标本制备及观察实验

肾上皮细胞

高锰酸钾 秋水仙素 PBS Formvar液

显微镜 相差显微镜 透射电子显微镜 镍网 载玻片 盖玻片 培养皿 CO2培养箱

一、高锰酸钾固定法显示用药（秋水仙素处理）前后CV-1细胞生物膜系统光镜标本的制备及观察。

1.  取无菌盖玻片，分别放入二个直径5 cm 的培养皿中，接种CV-1细胞，加3 ml 培养基。

2.  加盖做好标记，移入CO₂培养箱培养24小时。其中一个培养皿在终止培养前4小时，加入10 ug/ml 秋水仙素0.3 ml。

3.  在倒置显微镜下观察选定长有铺展良好细胞的盖玻片，终止培养，倒掉培养液。

4.  PBS液冲洗盖玻片二次，清除细胞表面的培养基和杂质。

5.  取出盖玻片，将长有铺展良好细胞的盖玻片，细胞面朝上放在载片上。

6.  滴新配制的高锰酸钾固定剂于盖玻片上，固定10分钟。

7.  蒸馏水轻轻地冲洗标本的细胞面5次，去除残留固定液。

8.  取下盖玻片，用滤纸吸干多余水份，滴1滴PBS液于载玻片上，将盖玻片附有细胞面朝下，装片。

二、高锰酸钾固定液显示用药（秋水仙素处理）前后CV-1细胞生物膜系统电镜标本的制备及观察。

1.  用0.5%Formvar液制做支持膜。

2.  将覆有Formvar膜的镍网经紫外线灯灭菌后，放入直径5 cm 的无菌培养皿中，加培养基3ml。

3.  接种CV-1细胞于铺有支持膜的镍网上，一组是不经药物处理的作为对照组，另一组是经10 ug/ml 秋水仙素处理的作为实验组。

4.  实验组的培养细胞在终止培养前4小时加入10 ug/ml 秋水仙素0.3 ml，放入CO₂培养箱中进行细胞培养。

5.  待细胞铺展开后，取出镍网，用乳头吸管滴1滴高锰酸钾固定液于镍网上，固定细胞10分钟。

6.  经上升梯度乙醇系列脱水：30%→50%→70%→85%→90%→95%→100%，每次脱水3分钟。

7.  待镍网晾干后，在透射电子显微镜下（75 KV 电压）进行观察。

三、结果

1.  在光镜下和透射电子显微镜下，内质网呈网状铺展于整个细胞质内。

2.  细胞核周围的内质网形成较稠密三维结构，远离细胞核周围的内质网则呈松散的网状伸展至细胞边缘。

3.  在电镜下可见内质网由细管和扁囊构成。除内质网外，还可看到粗大的呈条索状的线粒体，也可观察到高尔基器和溶酶体等膜性结构。

4.  CV-1细胞经秋水仙素处理后，其内质网向细胞核周围聚集，细胞边缘区域不再观察到内质网。

5.  秋水仙素破坏微管结构，因此，内质网的分布可能与微管的存在有密切关系。