斑点免疫金银染色检测牛结核血清抗体

实验概要

本实验应用斑点免疫金银染色(Dot－IGSS)检测了牛结核血清抗体。

主要试剂

1．抗原牛结核PPD。

2．血清待检血清、标准结核阳性血清和结核阴性血清。

3．硝酸纤维膜孔径0.45µm。

4．氯化金(优质)

5．0.2Mol/L PB液

6．0.05Mol/L Tris—HCl缓冲液

7．硝酸银显影液(现用现配)：

   明胶(20g/L) 6.00ml

   对苯二酚(57.90g/L) 3.00ml

   硝酸银(25g/L) 0.20ml

    pH3.5柠檬酸盐缓冲液 1.00ml

   对苯二酚和硝酸银溶液需避光保存，临用前将明胶加热溶解后，按上述比例依次混合。

8. pH3.5柠檬酸盐缓冲液的配制：

   柠檬酸(C₆H₈O₇·H₂O) 25.50g

   柠檬酸三钠(C₆H₅Na₃·2H₂O) 3.50g

   去离子水加至 100.00ml

   溶解后即可使用。

9. 定影液

   硫代硫酸钠(Na₂S₂O₃) 20.0g

   去离子水加至 100.00ml

   溶解即可。

10. 兔抗牛IgG抗体。

实验步骤

1. 胶体金的制备试验用水均要求三蒸馏水并过去离子柱，最终去离子水的电阻大于100万Ω。所有容器最终均用去离子水清洗。

   1) 采用鞣酸-枸橼酸钠还原法制备

   A液 1％HAuCl₄ 2.00ml

   去离子水 158.00ml

   B液 1％枸橼酸钠 8.00ml

   0.1％Mol/L K₂CO₃ 0.20ml

   1％鞣酸 0.20ml

   去离子水 31.60ml

将A液和B液分别于60℃水浴30min，并不时搅拌，迅速将B液加入至A液中，搅拌，颜色为深蓝色，继续加热至100℃，5 min～10min，溶液颜色变为深红色，自然冷却后4℃保存。

   2) 胶体金鉴定：外观呈深红色、晶莹透亮，迎着日光可见有光带。电镜观察胶体金粒子大小平均为10nm，颗粒大小一致，分布均匀。

2. 胶体金与兔抗牛IgG用量比例的确定每ml胶体金所需的最低稳定蛋白量是30µg，根据试剂用量增加20％，所以每ml胶体金所需的最低稳定兔抗牛IgG量为36µg。

3. 金标记兔抗牛IgG的制备取所需量的兔抗牛IgG，加入少许去离子水，用0.1Mol/L K₂CO₃溶液调pH值为9.0(用精密pH试纸测定)，同时胶体金溶液的pH值也调至9.0。在磁力搅拌下，将20ml胶体金溶液加入至兔抗牛IgG中，继续搅拌10min，加入3.5ml 3％的聚乙二醇(分子量20 000)作为稳定剂，以使其最终浓度达到0.05％，再搅拌15min后，置4℃冰箱保存备用。

4. 金标兔抗牛IgG的纯化将金标记的兔抗牛IgG以2 500r/min离心15min，以除去胶体金的聚合物，取上清以65 000g离心1h，可见离心物分为三层，上层为淡黄色，含有未结合的兔抗牛IgG，下层为近黑色，是尚未结合的胶体金颗粒,最主要的中间层为红色，是结合良好的金标记的兔抗牛IgG，倾去上层，收集中层液，用含0.1％BSA的0.01Mol/L pH8.2PB混合至原体积的1／10，过滤除菌，分装，4℃保存备用。

5. 金标记兔抗牛IgG的鉴定

   1) 颗粒大小及均匀度鉴定：取少许金标记的兔抗牛IgG，负染，电镜观察颗粒大小及均匀度，并测量粒子直径大小。

   2) 活性鉴定：将牛IgG点样于硝酸纤维膜上，直接加金标兔抗牛IgG抗体，应显示出明显的粉红色斑点。

6. 正式试验程序

   1) 点样以打孔器将微孔滤膜制成直径3mm的膜片。将牛结核PPD用0.01Mol/LpH9.0PBS液稀释为40µg/ml，用微量加样器加1µl抗原于膜片中央，37℃烘干10min。

   2) 封闭将膜片置于0.01Mol/L pH7.4含0.2％BSA的PBST液中，37℃作用45min，其间振荡数次。取出后以蒸馏水洗涤1次，用滤纸吸干。

   3) 加待检血清待检血清以PBST液做1:160倍稀释。将膜片浸入其中，37℃作用1h，其间振荡数次。取出后，以PBST液洗涤后，滤纸吸干。此步同时设标准阳性血清和阴性血清对照。

   4) 加金标抗体以PBST液将金标液作1:10稀释，将膜片浸入其中，37℃作用2h，中间振荡数次。

   5) 银染将膜片从金标液中取出，于去离子水洗涤3次，每次3min。然后将膜片浸入暗室中的银染色液中，室温下作用10min，移入定影液中，室温作用5min。然后用去离子水冲洗，自然干燥后观察结果。