斑点酶联免疫吸附测定

实验概要

斑点酶联免疫吸附测定法(DotELISA，DELISA)是以纤维素膜代替免疫酶固相载体法中常用的聚苯乙烯微量反应板而建立的一种免疫检验方法。DELISA不仅保留了常规ELISA的优点，而且还弥补了抗原或抗体对载体包被不牢等不足，所以具有敏感性高，特异性强，被检样品用量少，节省材料，不需特殊仪器，结果判定简单易行和便于长期保存等特点。因此，该法自问世以来，以其独特的优势，广泛应用于抗原抗体的检测和杂交瘤细胞的筛选等。

实验原理

DELISA的基本原理与常规ELISA和免疫酶染色法基本相同，即将抗原或抗体首先吸附在纤维素薄膜(如硝酸纤维素膜，NC)表面，并保持其免疫活性，通过与相应的抗体或抗原和酶标记物的一系列免疫反应，形成酶标记抗原抗体复合物，在底物的参与下，结合物上的酶催化底物使其水解、氧化成另一种带色物质，沉着于抗原抗体复合物吸附的部位，呈现出肉眼可见的颜色斑点。试验的结果可通过颜色斑点的出现与否和色泽深度进行判定。DELISA常用的检测方法有直接法、间接法、双抗体夹心法、双夹心法和竞争法等。

主要试剂

1. 载体：硝酸纤维素膜022～045μm,Schleiche & Schucll或国产；混合硝酸纤维素膜022μm。

2. 保温液及洗涤液：保温液为含01%BSA、005%Tween20 PBS(001mol/L,pH值74)；洗涤液为005%Tween20 PBS。

3. 封闭剂：含1%BSA或4%蛋清或3%白明胶的PBS。

4. 口蹄疫单抗：口蹄疫病毒A型单克隆抗体(AFMcAb)、O型多克隆抗体(OFPcAb，由O型标准病毒免疫BALB/c鼠制得)。

5. A、O、C、ZB型口蹄疫标准抗原。

6. 冻干辣根过氧化物酶标记兔抗BALB/c鼠抗体。

7. 底物溶液：3,3二氨基联苯胺50mg,005mol/L、pH值76 TrisHCl 缓冲液100ml，溶解后过滤，4℃避光保存。临用前按003%加入H₂O₂。

8. 被检抗原的制备：水疱液可直接点样。水疱皮用生理盐水洗净，晾干，称重，剪碎，加中性玻璃砂研磨，用生理盐水制成1∶5～1∶10悬液，室温浸泡2h，振摇后，1 500～2 000 r/min离心10min，上清液即可用于点样。

实验步骤

1. 压迹：根据样品的数量剪取一片硝酸纤维素膜或混合纤维素膜。用直径3～5mm圆形打孔器(琼脂平板打孔器)，在膜的光滑面按顺序压上痕迹，作为点样部位。将膜置蒸馏水中浸泡，待完全浸湿后，取出室温自然干燥。

2. 点样：用微量移液器分别吸取1～2μl(或用玻璃棒、毛细管蘸一滴)被检抗原液，滴于圆圈内，自然干燥。为增加抗原吸附量，也可在点样干燥后，再进行第二次点样。同时作阴、阳性抗原对照。

3. 封闭：将膜置平皿或小池内，加入封闭剂，37℃浸泡30～60min。取出稍置片刻，用洗液漂洗2次，晾干。

4. 与AFMcAb或OFPcAb反应：用保温液对AFMcAb或OFPcAb作适当稀释，加入反应池中，于37℃覆盖膜2h。

5. 洗涤：用洗涤液漂洗膜3次，每次3min，晾干。

6. 与酶结合物反应：冻干辣根过氧化物酶标记兔抗BALB/c鼠抗体用保温液作1∶80稀释，37℃覆盖膜1h。

7. 洗涤：3次，方法同上。

8. 显色：将膜浸入底物溶液中，避光染色5～15min。

9. 终止反应：用蒸馏水漂洗滤膜，晾干。

在应用DELISA间接法、双抗体夹心法等检测方法时，如果膜上包被的是已知的标准抗原或抗体，而不是被检样品，为了操作方便，可将上述的“诊断膜”按压迹剪成小片，置微量反应板的小孔中。在微孔中，“诊断膜”与相应的被检样品和诊断液发生一系列的抗原抗体反应和酶促反应。在试验中，被检样品和诊断液的用量均为每孔50μl，其他反应条件和操作法与常规ELISA相同。

注意事项

1. 点样量不易过大，以免溢出压迹圈外，造成各样品混合，如要增加样品吸附量，可在一次点样干燥后，再进行第2次点样。

2. 膜包被后，一定要封闭确实，防止抗原或抗体的非特异性吸附，避免膜本底染色过深。

3. 结果判定时，应与阴、阳性对照斑点反复比较，尽量克服肉眼观察所带来的误差。