新型扩增多潜能干细胞的分离、培养和鉴定的实验方案

　　小鼠胚胎发育从单个受精卵到8细胞早期具有全能性，即单个卵裂球具有分化为胚胎和胚外组织各种类型细胞的潜能。8细胞后期胚胎开始第一次谱系分离，外层的细胞形成滋养外胚层（TE），以后分化为胎盘的主要细胞成分，滋养层细胞；内在的细胞形成内细胞团（ICM），在囊胚阶段，内细胞团进一步分化为上胚层（epiblast）和原始内胚层（primitive endoderm），两者分别分化为胚胎的三胚层，原始生殖细胞和胚外组织卵黄囊。在小鼠囊胚阶段，从滋养外胚层，上胚层和原始内胚层在体外能够分别建株滋养层干细胞（TSC）、胚胎干细胞（ESC）和原始内胚层干细胞（XEN cells）。现已有在体外培养有类似全能性的胚胎干细胞的报导。

　　香港大学的刘澎涛教授（此前为英国剑桥桑格研究所的资深研究员）的实验室一直从事小鼠胚胎发育和胚胎干细胞，诱导多能干细胞（iPSC）方面的机理研究。2017年10月，他们在Nature杂志上报导了通过用小分子化合物抑制小鼠早期胚胎发育关键的MAPK、Src和Wnt信号通路开发的一种新型的扩增多潜能干细胞培养基（EPSCM），成功地从小鼠8细胞期胚胎和单个卵裂球分离，建株了扩增多潜能干细胞（EPSC）；此外也可以通过将常规的胚胎干细胞或诱导多能干细胞在EPSCM培养，使它们获得扩增多潜能性【1】。

　　全基因转录组分析表明EPSC介于4细胞和8细胞期胚胎之间。将一个或6-8个EPSC注射8细胞胚胎后，在体外胚胎发育到囊胚期后，检测发现EPSC可以整合入胚胎的内细胞团和滋养外胚层，而一般的ESC只参与内细胞团的发育；如果将注射的胚胎植入待孕的小鼠，在胚胎发育的6.5和14.5天在胚体和胚外组织、卵黄囊、胎盘都能检测到从EPSC分化而来的细胞。此外，在体外通过改变培养条件，可以使EPSC 转变为ESC，XEN cells和TSC，并在体内具有相应地分化潜能；而一般的ESC只有通过遗传学的方法下调或上调与ESC，TSC 干性维持有关的基因如Cdx2，Oct4等使之成为TSC样的细胞，且这些细胞在体内不能有效地分化为胎盘滋养层细胞。

　　1月7号，刘澎涛教授实验室在Nature Protocols在线发表了该实验室上述相关研究的实验方法【2】，详细介绍了从完整的8细胞胚胎，单个的8细胞卵裂球在EPSCM培养建株EPSC，将一般的ESC和小鼠胚胎成纤维细胞重编程得到的iPSC在EPSCM培养，传代转化为EPSC。

　　他们发现在ESC向EPSC转变的过程中Axin2和H19这两个基因的表达分别下调和上调，可以通过定量PCR初步鉴定EPSC，然后通过显微注射进一步进行EPSC的体内分化功能鉴定。同时，作者发现8细胞胚胎在EPSCM里培养会经过一个称之为’filled blastocyst’的阶段，免疫荧光染色结果显示，Oct4、Cdx2的表达短暂消失，然后出现一些Oct4+细胞，这些细胞可以增殖并形成EPSC克隆。如果将’filled blastocyst’分散为单个细胞，根据细胞的大小，至少可以划分大、中、小三种细胞，克隆形成实验表明只有小细胞才能形成克隆。目前，该实验室正在运用单细胞技术研究8细胞胚胎在EPSCM培养的转录组和表观遗传改变以及小分子化合物的作用机制等。

　　除了成功分离，建株小鼠EPSC， 该实验室也已在人，猪以及其他大动物EPSC的分离、建株、鉴定方面取得了很大的进展，相关结果已投稿。因除了小鼠、大鼠和人以外，其他物种的胚胎干细胞或诱导多能干细胞的建株尚未成功或功能不确定。不同物种EPSC的成功建株，不仅会极大地促进我们对相关物种胚胎发育的了解，也有利于干细胞研究向临床医学和畜牧业的转化应用。