新生大鼠心脏细胞的分离和培养实验

Sprague Dawley 幼鼠

胰酶液 乙醇

搅拌台 烧杯

组织消化和分离细胞

1. 在细胞操作间内，放一个加热搅拌台，上放一个装有 100 ml 灭菌水的容量 600 ml 的烧杯，加热至 37℃。

2. 准备胰酶液。用水浴或温箱使胰酶液温度保持在 37℃。

3. 做一个冰台：将一只平皿装满冰后倒置即可，70% 乙醇擦拭平皿后放进操作台。取 3 个 60 mm 的一次性组织培养用平皿，加入 5 ml 盐水 A，标记上 1，2,3 放进操作台的冰台上。

4. 取一只干净加盖的烧杯，内放一块 Metofane 饱和的纱布，把 0~1 日龄的 Sprague Dawley 幼鼠放进该烧杯中麻醉。20 只 幼鼠大约需要 5 分钟时间。用 70% 乙醇擦净烧杯再放进操作间。

5. 一次取出一只幼鼠，一定要再盖好盖子，然后将幼鼠躺着放在一块无菌纱布上，用乙醇擦洗其胸部及腹部。把鼠肩胛骨往后夹，使突出胸腔，在肋骨下沿胸骨方向拉一口，摘出心脏放进标记着 1 的培养皿中。

6. 继续处理余下的幼鼠，一定要保持手套及所用器械洁净，每次解剖约需 1 分钟。

7. 上述操作完成后，用两把 5 号钳子剔除心脏上结缔组织和血块再转入标记为 2 的培养皿中。再洗一遍，转入标记为 3 平皿中。

8. 取一只无菌巴斯德吸管轻轻把平皿 3 中的盐水液 A 吸出，然后加入 2 ml 孵育过的胰酶液。用准备好的第二把无菌解剖刀把心脏切碎成沙粒大小。

9. 把上述切碎的心脏及胰酶液转入加了搅拌子的锥形瓶中。另外吸取 3 ml 新鲜的胰酶冲洗平皿和剪刀并转入锥形瓶，补加胰酶至终体积 10 ml，加上塞子，放入 37℃ 水浴中。打开搅拌器，调节转速至 60 r/min 左右，消化 15 分钟。

10. 从水浴中拿出锥形瓶，小心吸去上清，上清中的主要成分是血红细胞，加入 10 ml 新的胰酶，37℃ 水浴再作用 15 分钟。

11. 弃上清。加入 10 ml 新的胰酶，用一支一次性带刻度的吸管吹打溶液两次，机械分散细胞，再孵育 10 分钟。

12. 上述消化处理的同时，往一支 50 ml 的一次性无菌锥形管中加入 10 ml 冷的接种培养基。

培养已分离出的细胞

13. 消化处理之后，小心移出上清至上述加有接种培养基的锥形管中，这就是第一次收集到的分离出的细胞。余下的组织块中加入 10 ml 新胰酶继续消化。

14. 消化的同时，上述含培养基和细胞上清的锥形管以 1200 r/min 离心 4 分钟。轻轻吸去上清，加 5 ml 接种培养基重新悬浮细胞团。

15. 重复 11~14 步骤 9 次，或直至只剩余少许组织块为止。将所用细胞悬液集中于一支锥形管中。

16. 最后一次沉淀细胞，加接种培养基至 10 ml，吹打几次以散开所有细胞团。

17. 将上述 10 ml 悬液转移到 100 mm 规格的无菌组织培养平皿中，于 5% CO₂，高湿度的 37℃ 温箱中放置 1~1.5 小时，目的是减少成纤维细胞的污染。

18. 孵育后，收集所有平皿中的培养液，培养液中包含非贴壁细胞，每个平皿用 10 ml 预温的接种培养液冲刷后收集。量一量最后收集溶液的体积，用台盼蓝拒染法计数细胞。一般地，总细胞数在 5X10⁷~1X10⁸ 间，成活率约 85%。

19. 用接种培养基将细胞密度调整至 5X10⁵~6X10⁵ 细胞/ml，制成接种液。

20. 每只 35 mm 规格平皿加 2 ml 上述接种液，60 mm 规格的平皿加 5 ml 的接种液，孵育 4~6 小时。

21. 4~6 小时后，用培养基或盐水液 A 轻轻洗涮平皿两次，倒掉，加入交换培养基继续孵育过夜。

22. 用培养基或盐水 A 冲洗平皿两次，加入新配制的交换培养基，继续温育，两天换一次液。