新的生物湿／软样品制备方法让电子显微镜拍照不再难！

　　电子显微镜(SEM)，是帮助我们了解微观的重要工具。通常，我们进行材料表征时，第一步就是给样品拍电镜。因此，样品拍电镜前的处理过程就是我们必须要进行的。一般而言，这个处理过程简单快捷，可当我们在处理软/湿生物材料时（离体组织，带细胞材料等），整个过程就变得复杂且耗时了。这一过程包括样品的固定、脱水、干燥及金属溅射等固定步骤（梯度脱水就让人崩溃），还夹杂着脱醇、梯度冻干、离心等可选步骤。往往样品处理一项，可能耗时几天。过程复杂，就容易出纰漏，当看着我们因样品处理失误而导致的“奇丑无比”的图片时，真是百感交集。

　　为了解决样品处理复杂耗时这一难题，韩国科学技术院的Seonki Hong教授研究团队提出了一种生物湿/软样品制备方法，用于SEM分析形貌。该方法利用连苯三酚(pyrogallol，PG)/聚乙烯亚胺[poly(ethylenimine)，PEI]对样品进行表面处理，涂上涂层后发生氧化交联反应，在样品表面形成一层酚-醌/胺膜，锁住内部水分（避免水分在高真空中产生剧烈地汽化，影响真空度、污染样品，破坏样品的微细结构）。这样，样品可直接进行电子显微镜拍照，大大缩短实验时间。与此同时，涂覆的保护膜还具有保温，提供力学支撑的能力。简单的涂层处理真可谓一举多得。该研究成果以题为“A nature-inspired protective coating on soft/wet biomaterials for SEM by aerobic oxidation of polyphenols”的论文发表在《Materials Horizons》上。文章第一作者为Hong Key Park。

　　酚胺氧化涂层设计

　　天然研究者发现在水/空气界面，氧化后的苯酚-醌物质可与多胺发生交联反应，在空气/水界面形成酚-醌/胺膜。同样的，类似的酚类氧化现象也存在于水果之中（Fig.1a,b,c）。发现该涂层能保护软/湿材料在高真空下不脱水，并起到隔热作用，防止低温软材料熔化/变形。操作很简单，研究者将连苯三酚(pyrogallol，PG)/聚乙烯亚胺[poly(ethylenimine)，PEI]涂在海绵表面，暴露在空气中3min后，海绵表面颜色从黄棕色变成深褐色（Fig.1d,e），就像苹果放在空气中被氧化，原理非常的相似，这里发生的是氧化交联反应。

图1所示：连苯三酚氧化并与聚乙烯亚胺聚合。

　　酚胺氧化涂层样品电子显微镜成像

　　以往在进行扫描电子显微镜(SEM)成像之前，湿/软样品需要经过处理。以防止成像过程中，样品在高真空条件下脱水导致结构坍塌和变形。经过酚胺氧化涂层的湿/软样品可直接进行扫面成像（Fig.2a）。这一替换将固定、脱水、临界点干燥、金属溅射等繁琐过程替换为一个耗时不到5分钟涂层步骤。

　　研究者进一步研究涂层方法对于最后成像结果的影响并得出结论：对于小的、微尺寸的样品，用过滤离心法涂覆涂层。其中聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)微球涂覆酚胺涂层，zeta电位为+18.7 mV（PEI带正电），而对照组为-22.7 mV。SEM结果进一步表征了这些微球的表面形态，未发现裸球和酚胺处理过的微球在形状和尺寸上有差异（Fig.2b）。对于柔软的样品，由于其高度的柔韧性，不能进行浸涂，则在固体支架上进行自旋涂覆。样品在涂层和未涂层后没有明显的厚度差异（Fig.2c）。

图2所示：酚胺氧化涂层样品电子显微镜成像。

　　基于此种方法，研究者实现了一系列生物湿/软样品进行成像包括植物叶片、猪脂肪、猪肾和猪肝且获得了一系列组织图像（图3）。

图3所示：酚胺氧化涂层的各种生物组织的SEM图像。

　　小结

　　最后，研究者得出结论，他们开发了一种通过酚胺氧化交联反应对生物软/湿样品涂层的方法。经过涂层后，在样品表面形成致密的膜类似于昆虫的外壳，将水分牢牢地包在内部，保证在电镜拍摄的高真空环境中，不发生剧烈地汽化，影响成像质量。研究者成功地将数天的处理过程缩短至不到5分钟，极大地提高实验效率。

　　同时，涂覆的涂层还具有隔热及提供力学支撑的作用，这些特点对提高成像质量具有重要意义。