方案22.3贴壁细胞的克隆形成实验

材料

无菌

生长液
D-PBSA
0.25%粗制胰蛋白酶
待测化合物配制成最大使用浓度的10倍，溶于无血清生长液中；检査试验溶液的pH 和渗透压，若需要的话，予以调整；
培养瓶，25cm²
培养皿，6cm 或9cm，在底皿的边上做标记

非灭菌

D-PBSA
甲醇
1 % 结晶紫
血细胞计数板或电子细胞计数器

操作步骤

1. 准备一系列在25cm²的培养瓶中培养的细胞，6 组试剂浓度，每组各3 瓶，另有3 组作对照。在每个培养瓶中接种4.5 ml 细胞悬液（细胞密度为每毫升生长液5X10⁴个细胞），温育48h ，届时细胞将进入对数生长期（见21. 9.2 节）。

2. 制备一系列待测物质的稀释液，每组2ml，为所需终浓度的10倍：

(a) 若是首次测试的化合物，在3～5 个对数生长范围内采用5 倍稀释；
(b ) 若是能够预测大致的毒性浓度，那么就选择一个较窄的算术范围，每组相隔10或20 数量级。

3. 在每组浓度的3 个培养瓶中各加人0.5 ml 10倍浓度的待测化合物，使其稀释10倍。先从对照组（不含待测物质）开始，然后从低浓度向髙浓度进行。

4. 将培养瓶放回孵育箱。

5. 若化合物作用缓慢或可部分逆转，那么重复第3 步两次，也就是将细胞暴露在试剂中3 天，每日更换培养基及化合物，这样培养基及待测化合物即可得以更新。对于快速作用的化合物，暴露1h就已足够。

6. 依次将每组3 瓶中的生长液倾去（从最低浓度向最高浓度进行），用胰酶消化细胞。

7. 将细胞稀释至克隆生长所需的密度（见方案14.1)，接种于培养皿中。以与对照组相同的数量稀释所有细胞，从最高浓度的培养瓶至最低浓度组，最后稀释对照组。

8. 温育细胞直至集落形成。

9. 用无水乙醇固定细胞，用1% 结晶紫染色10min (见方案16.3)。

10. 用自来水清洗培养皿，吸去水分，倒置干燥。

11. 对多于50 个细胞的集落（多于5个世代）进行计数。生长曲线的分析

12. 计算每组药物浓度下的细胞贴壁效率。

13．计算相对贴壁效率：每组浓度的贴壁率/对照组的贴壁率，这是细胞存活分数。

14. 依据所用的的浓度范围，在对数或线性药物浓度下，绘制细胞存活分数曲线图（图22.2)。

15． 确定IC₅₀或IC₉₀，它们分別是50% 或90% 的集落形成被抑制时的化合物浓度。由于这是一个半对数曲线图，IC₉₀更为适用，因为它更可能落在曲线的线性部分；而IC₅₀。往往落在曲线的弯曲部分，这样它的稳定性就比较差。

16.敏感性差异曲线的分析：
(a) 曲线的斜率和弯曲部分的长度。曲线的斜率较浅和/或弯曲部分较长表示敏感性降低；斜率较陡和/或弯曲部分较短表示敏感性增加。弯曲部分的长度及斜率对IC₅₀和IC₉₀均有影响，而在IC₉₀可以观察到更显著的差异（图22.3)，并且IC₉₀常作为一个简单的导数；
(b) 抗性分数。细胞抗性分数是指曲线下端的平坦部分；
(c) 缺乏曲线梯度则表示所有细胞均有抗性；
(d) 曲线下面积：复杂的生存曲线可以通过计算曲线下的面积进行比较，但这样做只是为了方便，从数学上来讲并不是很有根据。