时间分辨荧光免疫分析在乙肝病毒血清学标志物检测应用

乙肝病毒 (Hepatits B veius HBV) 感染是我国最常见的感染性疾病之一，而应用免疫技术测定 HBV 特异性抗原抗体是 HBV 感染诊断的主要手段。由于免疫学技术的不断发展，抗原抗体检测灵敏度明显提高，使低水平 HBV 感染得以检出，对临床诊断及流行病学有重要意义 [1] 。另外，由于可进行定量分析，这对药物疗效观察和病情监测具有重要意义 [2] 。时间分辨荧光免疫分析技术 (time resolved fluorecence immunanssay TRFIA) 是一个灵敏度高、特异性强的新的免疫检测技术，本文应用这一技术对来我院就诊的 HBV 感染者及正常人进行了检测，并与 Axsym 微粒子酶免分析法 (MEIA) 进行了方法学比较，其结果如下：

一、材料与方法
1、标本来源 :
（ 1 ） 正常人血清：取自我院体检正常人群 180 份。
（ 2 ） 乙型肝炎患者血清：取自我院住院及门诊患者 46 份。
（ 3 ） 质控血清：
①卫生部临检中心质控血清（批号为 0207 ）浓度分别为： 0.2ng,0.5ng,1.0ng,5.0ng
②北京市临检中心质控血清（批号为 0209 ）浓度分别为： 2.0ng,5.0ng

2、方法和试剂 :
（ 1 ） 参照方法：微粒子酶免分析法 (MEIA) 采用 Axsym 全自动免疫分析仪及配套试剂，为美国 Abbott 公司产品，试剂批号为 HBsAg 91046LU00. HBsAb 89348LU01. HBeAg 88314HP00. HBeAb 84053HP00. HBcAb 88058LU00.
（ 2 ）测试方法：时间分辨免疫荧光分析法 (TRFIA) 采用 AT-2000 时间分辨荧光免疫分析仪及配套试剂，为上海新波生物技术有限公司产品。试剂批号乙肝两对半均为 20020726.

二、结果与分析：
1、HBsAg
   TRFIA cut off 值 HBsAg 浓度≥ 0.5ng/ml 为阳性，
   MEIA cut off 值 HBsAg 浓度 S/N>2.0 为阳性，其二法定性结果见表１

表 1 TR-FIA 和 MEIA 检测定性结果四格表

灵敏度 46/(0+46)*100%=100%
特异性 46/(46+0)*100%=100%
诊断符合率 100%

　　使用 TRFIA 方法对本地区 180 例正常人进行 HbsAg 测定，结果呈正态分布 : 均值 0.12. 标准差 0.062 。该调查结果符合中国药品生物制品检验所规定最低检出量 0.5ng/ml 。并与 Abbott 公司配套肝炎诊断方法（ MEIA ）比较，相关系数为 0.833, 具有较好相关，该法检测灵敏度为 0.36ng/ml 。卫生部临检中心 1ng/ml 质控血清对照 : 均值 1ng/ml. 标准差 0.15. 变异系数 15% 。

　　ELISA 方法及金标法检测灵敏度分别为 0.5ng/ml 和 5ng/ml 。提示该法与 MEIA 的灵敏度相似，能检测到低浓度之 HBsAg, 初步解决了隐源性肝炎中 HBV 标志检测的问题。 [1]

2、HBsAb
   TRFIA cut off 值的 HBsAb 浓度≥ 10mIU/ml 时为阳性，
   MEIA cut off 值的 HBsAb 浓度 >10mIU/ml 时为阳性，其二法定性结果见表 2

表 2 TRFIA 和 MEIA 检测抗 HBs 定性结果四格表

灵敏度 22/(22+0)*100%=100%
特异性 64/(6+64)*100%=91%
诊断符合率 91%

3、HBeAg ：
   TRFIA cut off 值 HBeAg 的浓度 >0.03NCU/ml 为阳性 ,
   MEIA cut off 值 HBeAg 的浓度 S/CO>1.0 为阳性 , 其二法定 性结果见表 3

表 3 TRFIA 和 MEIA 检测 HBeAg 定性结果四格表

灵敏度 30/(30+0)*100%=100%
特异性 58/(0+58)*100%=100%
诊断符合率 97.7%

4、HBeAb ：
   TRFIA cut off 值 HBeAb>1.5NCU/ml 为阳性，
   MEIA cut off 值 HBe Ab S/N<1.0 ，其二法定性结果见表 4

表 4 TRFIA 和 MEIA 检测 HBeAg 的定性结果四格表

灵敏度 22/(22+0)*100%=100%
特异性 60/(8+60)*100%=88%
诊断符合率 91%

5、HBcAb ：
   TRFIA cut off 值 HBcAb>0.1NCU/ml 为阳性 ,
   MEIA cutoff 值 HBcAb S/N<1.0 为阳性 , 其二法定性结果见表 5 。

表 5 TRFIA 和 MEIA 检测 HBcAb 定性结果四格表

灵敏度 60/(60+2)*100%=96%
特异性 24/(2+24)*100%=92%
诊断符合率 95.5%

HbcAb 抗体均按 1 ： 30 倍稀释后，检测基本符合感染后的血清学标志物模式。

三、讨论 :
　　AXSYM 免疫分析仪微粒子酶免分析法 (MEIA) 检测 HBV 感染血清学标志物是公认的诊断 HBV 感染的方法。特点是：全自动，操作时环境不易被污染，但成本较高。目前国内检测 HBV 感染血清学标志物应用较多的仍是 ELISA 方法。其有以下缺点： 1. 无法定量； 2. 灵敏度低； 3. 由检测原理带来的前带现象无法解决； 4. 易污染，无法完成 HBV 感染的动态观察以及低水平 HBV 感染指标检测。免疫胶体金检测技术可大大缩短检测时间，不需要特殊设备，操作简单，但灵敏度欠佳，假阳性问题难以克服。

　　用 TRFIA 法做了 46 例乙型肝炎患者血清学标志物，其结果同时与 MEIA 法进行比较符合率分别为 HBsAg 100%,HBsAb 93.02%,HBeAg 97.75%,HBeAb 90.25%,HBcAb 91.67% 。

　　时间分辨免疫分析技术 (TRFIA) 是近年发展起来的无环境污染的高灵敏度免疫标记检测技术，因稀土离子本身激发光谱宽荧光发射光谱窄，使这一精密检测技术在普通实验室能够进行。它以稀土离子为标记物，通过时间延迟，去除非特异性荧光干扰，在固定时间检测特异性荧光，解决了自然背景干扰问题，明显提高检测灵敏度。并通过激发光与发射光之间较大的 STOKES 位移，明显排除非特异性荧光的干扰，提高了光谱的分辨率，使特异性明显增强。它与目前所使用的 HBV 感染标志物检测方法比较，是一种新的检测方法，灵敏度高、稳定性好、经济实用、符合国情。