昆虫全基因组DNA的提取

实验概要

利用改进的CTAB 法提取昆虫全基因组DNA。

主要试剂

1. 蛋白酶K[美国Merck公司]

2. 三羟甲基氨基甲烷(Tris)[美国Amresco公司]

3. Taq DNA聚合酶及dNTP[NEB公司]

4. 琼脂糖及溴化乙锭(EB)[美国Amresco公司生产]

5. 乙二胺四乙酸钠(Na2EDTA)[美国Amresco公司]

6. 苯酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇等[国产分析纯]

7. 电泳缓冲液TBE：浓贮存液5×TBE：54.0 g Tris碱，57.1 g硼酸，20 ml 0.5 M EDTA，pH=8.0，加蒸馏水定容至1 L，工作液为稀释的0.5×TBE

主要设备

1. 高速冷冻离心机(3K-30)[德国Sigma公司]

2. 恒温水浴锅[北京六一仪器厂]

3. 电泳仪[美国Bio-Rad公司]

4. 水平电泳槽[美国Bio-Rad公司]

5. 凝胶成像系统(Gel Doc EQ)[美国Bio-Rad公司]

6. 4℃、-20℃冰箱[日本Sanyo公司]

7. 紫外分光光度计(Beckman Du 650)[日本Sanyo公司]

8. 高压灭菌锅[日本Sanyo公司]

实验材料

烟粉虱成虫

实验步骤

改进的CTAB 法提取昆虫全基因组DNA:

1. 加入 50 µL TE 缓冲液，充分悬浮细胞样品；

2. 加入 60 µL 10% SDS 溶液，10 µL 20 mg/mL 蛋白酶K，温和混匀，37℃温育 1 h；

3. 加入 100 µL 5 mol/L 的 NaCl 溶液，上下颠倒离心管十多次，充分混匀；

4. 加入 80 µL CTAB/NaCl 溶液，温和混匀，65℃下温育 10 min；

5. 加入 700 µL 氯仿/异戊醇，温和混匀，12000 r/min 高速离心 2 min；

6. 吸取上清至另一干净离心管，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，上下颠倒混匀，12000 r/min 高速离心 2 min；

7. 吸取上清至另一干净离心管，加入 2 倍体积冰冷的无水乙醇沉淀 DNA，温和混匀；

8. 离心（12000 r/min，30 min，4℃），彻底去除上清；

9. 用 300 µL 70% 预冷的乙醇洗涤沉淀，离心（12000 r/min，15 min，4℃），弃上清，再离心几秒，用移液器彻底除去酒精，风干；

10. 沉淀溶于 100 µL TE 溶液中，-20℃保存；

11. 以紫外分光光度法和 0.8% 琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 浓度和质量。

DNA的浓缩与纯化：               

1. 将样品置于 1.5 mL 离心管中，在每一样品中加入等体积的酚/氯仿/异戊醇溶液，将管中样品振荡混合成乳状液体；

2. 室温下，12000 r/min 离心 1 min；

3. 吸取上层水相层到另一洁净的离心管中，再次加入等体积的酚/氯仿/异戊醇溶液，混匀，室温下 12000 r/mi n离心 1 min；

4. 吸取上层水相转移到另一洁净离心管中，加入等体积的水饱和乙醚，混匀，静置 5 min 待有机相与水相分层，弃上清乙醚；

5. 置于 68℃温育 10 min，不时用手指弹动管壁，使乙醚充分挥发；

6. 加入 1/10 体积的乙酸钠溶液（3 mol/L，pH5.2），上下颠倒离心管使溶液充分混匀；

7. 准确加入 2 倍体积的预冷的无水乙醇，上下颠倒混匀，-20℃静置 1 h使 DNA 充分沉淀；

8. 4℃，12000 r/min 离心 10 min，弃上清；

9. 加入 70% 预冷的乙醇至管中 2/3 体积，混匀漂洗以去除残余的盐，高速离心（4℃，12000 r/min，5 min），弃尽上清；

10. 室温放置 15 min 左右，使乙醇完全挥发，加入适当体积的双蒸水或 TE 溶液重溶 DNA 沉淀。