昆虫细胞的保存培养实验

草地夜蛾（Sf 9）细胞

70％乙醇 0.4％(m V)台盼蓝

无血清昆虫细胞培养基 60  mm 培养皿或 25  cm2 培养瓶 27℃ 培养箱 旋转细胞培养瓶 多转瓶的揽拌台 离心机 带螺口盖的冻存管 液氮罐

1. 将 3 ml 含 10％ 胎牛血清的昆虫细胞培养基 TNM-FH 加入到一个 60 mm 组织培养皿或 25 cm² 培养瓶中。

2. 取出一支冻存 Sf 9 细胞的安瓿，迅速置于 37℃ 水浴，用手前后摇动融化。当安瓿的内容物几乎完全融化时，将安瓿浸入 70％ 乙醇，消毒外壁。

3. 打碎安瓿颈部，将内容物转移至步骤 1 的 60 组织培养皿或 25 cm² 培养瓶。用手轻轻摇动，使细胞分散均匀，置 27℃ 温育 2～3 h 直到细胞贴壁。

4. 除去旧培养液，换 3 ml 新鲜培养液 TNM-FH/10％FBS，继续温育。每 3 天换液一次（除去旧培养液换新鲜的），直到细胞生长汇片（形成拥挤的单层培养物）。

5. 当 Sf 9 细胞已生长汇片时，弃去培养瓶中的培养液。加入新鲜的完全培养液，用移 液管轻柔吹打重悬细胞。

6. 用为培养组织细胞设计的血细胞计数器计数细胞。在血细胞计数器小方格上的每一个细胞相当于 10⁴ 细胞/ml。

7. 在一个新的 60 mm 组织培养皿或 25 cm² 培养瓶中接种来自步骤 5 的（1～2）× 10⁶ 个细胞，摇动培养瓶使细胞均匀分布（如果制备大量培养细胞，可用大的培养瓶，装入更多的培养液）。加入新鲜培养液 TNM-FH/ 10％ FBS 至终体积 3 ml。

8. 27℃ 温育，每 3 天用 TNM-FH/10％ FBS 培养基换液，直到培养瓶中的细胞生长汇片。

9. 弃去汇片的单层培养细胞中的培养液，并重悬细胞（同步骤 5），用血细胞计数器计数细胞。

10. 以（4～5）× 10⁵ 细胞/ml 的密度将细胞接种于一个旋转培养瓶中，27℃ 温育，以 60～80 r/min 的速度恒速搅拌。轻微开启旁边的通气孔，以保证充足的空气。

11. 每隔 2 或 3 天进行细胞计数（见附录 3F）。当细胞密度达到（2～2.5）× 10⁵ /ml 时 进行传代，将适量细胞移至一个含有新鲜培养液 TNM-FH/10％ FBS 的新培养瓶中，使终密度达到（4～5）× 10⁵/ml。

12. 在 1 ml 对数生长的细胞中加入 0.1 ml 的 0.4％ 台盼蓝，测定细胞活力。在低倍显 微镜下检查细胞，计数被台盼蓝染色的细胞（死细胞）和总细胞数，计算出死细胞和活细胞的百分比例。

13. 将单层培养细胞（从步骤 5）或悬浮培养细胞（从步骤 11）传代至由 1 份完全 TNM-FH/10％FBS 培养液和 1 份无血清培养液（Bacu 10 Gold，Sf-900 II 或 ExCell 401）组成的混合培养液中。让细胞长至汇片（单层培养），或达到（2～3）× 10⁶ 细胞/ml 的密度（悬浮培养）。

14. 按步骤 13 的方法重复，将细胞传代至 TNM-FH/10％FBS 培养液与无血清培养液比例为 1 : 3 的混合培养液中，使细胞生长。

15. 按步骤 13 的方法，用完全培养液与无血清培养液比例为 1: 7 至 1 : 9 的混合培养液，重复细胞传代与细胞生长的步骤。

16. 用无血清培养液传代细胞。

17. 计数呈对数生长的待冻存细胞（见附录 3F）。

18. 室温以 1000 g（GH-3.7 转子为 2000r/min）离心 10 min， 弃去上清液。

19. 用 TNM-FH/10％ FBS 培养液以（1～2）× 10⁷ 细胞/ml 的密度重悬细胞团块。加入等体积含 20％ DMSO 的 TNM-FH/10％ FBS 培养液，将细胞置于冰浴。吸出 1 ml 细胞悬液，移入带螺口盖的冻存管中，置于 -20℃ 1 h，然后 -70℃ 过夜。

20. 将冻结的细胞移至液氮罐中以便长期保存。

1. 所有与活细胞接触的试剂和仪器均应无菌而且应使用相应的无菌操作。

2. 换液时要使培养皿倾斜一个角度，在一个角上移出和加入培养基以避免搅动单层细胞。

3. 细胞在无血清培养液中生长缓慢，需要几次传代才能恢复正常的生长速率和活性。

4. 步骤 12 中活细胞的百分比例应大于 97％， 为了保持在悬浮细胞中传递足够的氧气，必须保持表面积与培养体积成一定的比例。