显微操作技术在基因编辑中的应用（三）

图9：ESI注入8细胞阶段的胚胎。钝端毛细管

图10：EMBL转基因过程中使用的DMi8、Eppendorf TransferMan 4r显微操作器和PiezoXpert压电破膜仪。以钝端毛细管进行胚囊注射。DIC

用于小鼠转基因的CRISPR/Cas 9技术

用于小鼠转基因的CRISPR/Cas9技术为靶向突变提供了工具（如ESI），但无需繁杂的ES处理工作！（当然CRISPR也可以用于ES细胞突变）。

转录激活子样效应因子核酸酶（TALEN）技术是一种更为成熟的技术。TALE（转录激活子样效应因子）是结合DNA特定序列的蛋白质。TALE与核酸酶融合即为TALEN，这是一种具有高度特异性的DNA剪刀。TALEN使双链断裂。修复机制导致靶基因缺失或敲除。

目前，CRISPR技术相对于TALEN技术而言并不昂贵。

另外一种基因组编辑技术是锌指核酸酶技术，它通过在用户指定位置上造成DNA双链断裂而发生作用。

CRIPR/Cas9技术所用的工具如下所示：

向导RNA：这种RNA与用户修饰的靶DNA同源。向导RNA与DNA上的大约20个核苷酸结合。RNA链的其余部分用于结合Cas9核酸内切酶。需要对20个结合的核苷酸进行设计，以找到/发现靶序列。

Cas9核酸内切酶：切割效率高，有时甚至切割两个等位基因。

将向导RNA和Cas9蛋白（或Cas9的DNA或mRNA）注射到受精卵里，Cas 9切割DNA，修复机制开始起作用。该方法在第一代小鼠体内产生点突变的概率高。更先进的技术是注射携带靶基因或突变的同源DNA以及向导RNA/Cas9混合体。经由同源重组插入DNA相当有效。

小鼠转基因用CRISPR/Cas9的优点/缺点：

优点：

+  Cas  9切割效率非常高，有时甚至切割两个等位基因，即可获得同源1代小鼠！

+ 无需繁琐的ES细胞处理工作

+ CRISPR/Cas9技术不依赖于小鼠（而PNI和ESI则依赖），即它也可用于其他物种 （猪等）。

缺点：

-  迄今已公布的最长插入片段为3kB

-  目前lox P条件性敲除效率低

需要注射高浓度黏性分子（如RNA、蛋白质），会堵塞毛细管。因此需要更粗的毛细管，而且要求平角注射！

Cas9高效率地剪切DNA,DNA的修复机制造成了点突变。

*注射gDNA+Cas9+同源的DNA

图11：CRISPR/Cas9技术

典型的CRISPR/Cas9系统设置

与PN注射设置相同，以下除外：

将浓度较高的黏性CRISPR成分（RNA、蛋白质）注入受精卵时需要使用较粗的毛细管。这些毛细管结构笔直，内径较大，大多数实验室均制作。

因此极力建议沿着真正的平角方向注射（见图10），以避免胚胎受损。

此外，使用Piezo压电式破膜系统，可以更轻松地穿过透明带，尤其是质膜。

显微操作器水平移动，将目标片段注入悬浮细胞内

图12：受精卵注射过程的注射角度。显微操作器水平移动，零度角注射可使胚胎受损程度较轻。注射角度大于10° 将导致受精卵出现较大的“洞”，使其存活率降低。

徕卡显微操作器的移动角度可调，也就是说，即便角度较陡，注射角度本身也是零度角！

这是徕卡显微操作器的一大优点：黏性的向导RNA和cas9蛋白混合物所需的较粗毛细管（减少堵塞）可以沿着零度角方向注射！

其他实验室设备（转基因实验室）

-立体显微镜是选择和控制胚囊、ES细胞和毛细管必不可少的工具。（如TL5000、M80、Rottermann contrast）

图13：M80及TL5000 Ergo。PN注射后的双细胞阶段。

• DIC专用玻璃底器皿，一些实验室使用大号盖玻片

• 毛细管：若干公司提供即买即用产品。许多转基因实验室自己制作毛细管。

直线注射CRISPR/Cas9需要使用内径足够大的毛细管。转基因专家自己制作“高级”毛细管以达到最高效率。

需要工具：

• 拉针器（如Sutter、Narishige）

• 磨具（用于毛细管拉拔后加工）

• 显微拉制仪（用于弯曲毛细管）

上述显微操作器：

• 徕卡机械式显微操作器：转基因领域赞誉颇高的显微操作器类型。角度可调，即使毛细管角度较陡，也可获得零度注射角。稳健可靠，负载能力强，持久耐用。用户众多。当移动徕卡显微操作器的控制杆时，可以感觉到毛细管触及胚胎。

• Eppendorf TransferMan4r：全自动显微操作器，具有许多附加功能。可以平角注射。气压式、油压式、油压式带齿轮和Femtojet手动显微注射器经常用于其他显微操作器。性能最优，价格最高。

• Narishige：新式Takanome显微操作器无平角操作功能。配备MOM-202D和MON-202D后可以平角操作。油压式显微操作器当然首屈一指。注射器：IM 9B、IM 9C、IM-11、IM300。

防震：在很大程度上取决于注射室位于地下室还是高层建筑的十层（不管需要与否）。采用被动（铁板、沉重石桌、网球等）和主动设置。

参考文献

1. One-Step Generation of Mice Carrying Mutations in Multiple Genes by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering

2. Haoyi Wang, Hui Yang, Chikdu S. Shivalila, Meelad M. Dawlaty, Albert W. Cheng, Feng Zhang, Rudolf Jaenisch, Cell 153, 910-918, May 9, 2013

3. -Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system

4. Albert W Cheng, Haoyi Wang, Hui Yang, Linyu Shi, Yarden Katz, Thorold W Theunissen, Sudharshan Rangarajan, Chikdu S Shivalila, Daniel B Dadon and Rudolf Jaenisch, Cell Research (2013) 23:1163–1171. doi:10.1038/cr.2013.122; published online 27 Aug 2013