曹博团队联合MIT开创RNA绝对定量测序新技术

　　RNA高通量测序技术（RNA-seq）是研究基因表达与调控领域的重要技术手段。然而目前RNA测序技术只能实现相对定量，以及无法检测含表观遗传修饰或复杂高级结构的RNA分子，阻碍了RNA组学研究的进一步发展。

　　2021年4月15日，Nature Biotechnology 在线发表了曲阜师范大学曹博课题组与美国麻省理工学院Peter Dedon课题组合作，题为“Quantitativemapping of the cellular small RNA landscape with AQRNA-seq” 的研究论文。该研究开发的AQRNA-seq （Absolute Quantification RNA-seq），首次实现了细胞内RNA分子的高通量测序、绝对定量分析、表观修饰定位、代谢片段鉴定等全面组学分析，尤其是含有高度表观修饰的tRNA分子等；利用AQRNA-seq，从绝对定量的角度，成功描绘了结核分枝杆菌和人类癌细胞内tRNA/miRNA组的完整表达和代谢图谱。AQRNA-seq技术通过PCT Route，获得美国、欧洲及中国的ZL授权，有望推动RNA测序进入绝对定量新时期。

　　RNA组学研究，即通过对细胞内全部RNA分子进行系统研究，以从整体水平阐明RNA的生物学功能，是多年来后基因组时代生命医学领域的研究热点和重点。目前，RNA-seq作为RNA高通量定量分析的重要技术基础和通用手段，存在两点不足之处：（1）由于传统建库过程中，RNA分子的捕捉等步骤具有序列偏好性，只能用于分析不同样品间相同RNA分子的相对变化倍数，而无法实现同一样品中不同RNA分子的绝对定量；（2）RNA分子上的表观遗传修饰或复杂高级结构，可以阻断或影响逆转录反应，导致RNA-seq无法检测或定量分析含有修饰的RNA分子。

　　目前越来越多的RNA分子被发现含有化学修饰，而RNA绝对定量技术的缺失，限制了人们对细胞内RNA群体多样性和复杂性的进一步理解；因此，开发一种RNA高通量绝对定量技术，并克服RNA修饰的干扰，是RNA组学研究领域亟待解决的关键技术难题。

　　曹博课题组开发的AQRNA-seq技术提供了一套不同于传统方法的全新RNA建库策略，并精确定量分析所有关键环节（图1），最终实现了：1）对细胞内全局性RNA分子无偏差、高灵敏度捕捉；2）样品中所有小RNA的测序读数和拷贝数之间呈直接线性相关，从而对RNA分子绝对定量分析；3）克服RNA修饰对定量的干扰；4）精确定位RNA分子上的修饰位点。

图1 AQRNA-seq技术流程及RNA测序读数和拷贝数之间的直接线性关系

　　该研究进一步利用AQRNA-seq，针对tRNA因含有高度修饰而无法利用传统方法进行高通量定量分析的难题，完成了国际上第一个完整的tRNA及其衍生片段（tRNA-derivedfragments, tRFs）绝对定量分析的代谢图谱：以结核分枝杆菌为研究对象，揭示了其在生长期和潜伏期转变过程中，tRNA表达谱及其表观修饰的动态变化规律；同时，还首次发现了该细菌在应激过程中产生的大量未知新型tRFs（图2）。这一发现暗示tRNA和tRFs在结核分枝杆菌细胞周期中的重要调控功能，对特征性分子进行深入研究，将为肺结核的诊疗提供潜在RNA分子靶标。

图2 结核分枝杆菌进入潜伏期过程中tRNA表达谱及其表观修饰变化规律

　　该研究还从绝对定量的角度，解析了人类乳腺细胞在癌变发生不同阶段miRNA的变化规律（图3），发现了多个特征性miRNA分子，这些特征性miRNA分子为癌症诊疗研究提供了新型分子靶标；同时，AQRNA-seq揭示了已有研究中关于miRNA鉴定的误区：目前已知的多数miRNA异构体（isomers，'isomiRs'），即miRNA末端序列多样性并非天然存在，而是传统测序过程中的人为引入。这一发现刷新了人们对miRNA群体的认知，为鉴定miRNA的多样性和复杂性提供了重要参考。

图3 人类乳腺细胞癌变过程中特征性miRNA以及人为引入的末端多样性

　　另外，近期曹博教授课题组已经成功开发AQRNA-seq 2.0，通过进一步设计并优化多个关键步骤，在绝对定量的基础上，实现了PCR dimer-free的建库技术。该版本可以与现有small RNA-seq技术通用，同时解决了必须通过胶回收等手段，除去PCR引物二聚体的繁琐步骤，突破了限制RNA建库全自动化的关键限制因素，有望发展成为RNA测序的新型通用平台。