实验材料
| 试剂、试剂盒 | |
|---|---|
| 仪器、耗材 | |
| 实验步骤 | 3.1 提取总蛋白质 （见注释 5) ( 1 ) 将去塞的 10 ml 空离心管称重。我们选用韧性好的聚碳酸酯旋盖圆底高速离心管。 ( 2 ) 细胞碎裂：500 mg 新鲜组织（保存在 -80°C ) 在液氮中用研钵和杵捣成粉末状。 ( 3 ) 用 8 ml 预冷沉淀缓冲液将粉末再次溶解。 ( 4 ) 将混合物转移到称重过的离心管中。 ( 5 ) 用 2 ml 预冷沉淀缓冲液漂洗研钵。 ( 6 ) 将漂洗液也转移到离心管中。 ( 7 ) 轻轻上下翻转离心管 15s 混合，然后让蛋白质在 -20°C 沉淀 1h。 ( 8 ) 在 16000 g 离心 15 min ( 见注释 6)。 ( 9 ) 轻轻倒出离心管里的上清液。 (10) 用 10 ml 预冷漂洗缓冲液漂洗离心管中的沉淀（除掉残留的 TCA ) ，并让离心管在 -20°C 反应 1h。 (11) 在 16000 g 离心 10 min ( 见注释 6) 。 (12) 真空干燥沉淀 2 h。 (13) 用玻璃棒将沉淀打碎成粉末状。 (14) 连同干燥的沉淀一起称重离心管。 3.2 溶解蛋白质 ( 1 ) 用溶解缓冲液将粉末重悬。每毫克粉末用 10~30 μl 缓冲液溶解。这种缓冲液含有混合的离液剂（尿素、硫 脲）、去垢剂 （Triton-X 100，CHAPS ) 、还原剂 ( DTT) 、载体两性电解质（IPG 缓冲液)。 ( 2 ) 在室温，400 g 离心 4 min，去除不溶性物质（如细胞碎片）。 ( 3 ) 将上清液倒入一支干净的离心管。 ( 4 ) 在室温，400 g 离心 4 min，将上清液倒入一支干净的离心管。 ( 5 ) 在 -80°C 保存上清液。 ( 6 ) 根据 Ramagli 等 [8] 描述的方法，浓缩蛋白质可以用超过 6 次的重复定量实验。计算出平均浓度，每根 IPG 胶条上样 300 μg 蛋白质。 |
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