实验概要
本实验介绍了检测病毒滴度的方法。
实验原理
根据噬菌斑数计算病毒滴度。
主要试剂
1. 4% agarose gel:2g agrose 50ml 水,高压灭菌
2. 2×Grace(unsupplemented):9.14g粉末(invitrogen) 0.07gNaHCO3 H2O,调PH6.1,定容至100ml,无菌过滤
3. supplemented Grace:1×Grace添加3.33mg/ml Lactalbumin,3.33mg/ml yeastolate,无菌过滤
4. 高温灭活FBS
主要设备
1. 6孔板
2. 12ml离心管
3. 100ml无菌玻璃瓶
4. 无菌吸管
5. 70℃水浴锅
实验材料
杆状病毒, SF9:5×105cells/ml
实验步骤
1. 无菌条件下,2ml/孔细胞(5×105cells/ml)种入6孔板,室温孵育1h使其贴壁,孵育后镜检其贴壁程度;
2. 将4% agarose gel放入70℃水浴锅融解,空100ml无菌瓶与2×Grace放入40℃水浴锅预热;
3. 将杆状病毒用无血清supplemented Grace梯度稀释:10-1~10-8。
4. 弃6孔板内上清,快速加入稀释好的病毒,1ml/孔,复孔,室温孵育1h。
5. 配置上层琼脂:加20ml高温灭活FBS到2×Grace 100ml,25ml 2×Grace(含FBS) 12.5ml 无菌水 12.5ml 4% agarose gel,至预热的100ml无菌瓶,轻轻混匀,放入37℃水浴锅备用;
6. 弃6孔板内上清,快速加2ml上层琼脂,以防菌层干燥,静置10-20min使其凝固;
7. 将6孔板放入27℃培养箱,培养4-10天;
8. 计数板中噬菌斑,直至连续两天无变化,加1mg/ml中性红0.5ml,室温孵育2h后计数噬菌斑。
注:
病毒滴度(pfu/ml)=1/稀释倍数×噬菌斑数×1/每孔接种体积
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